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细胞实验课修改版

发布时间:2014-01-24 09:08:33  

实验一实验前准备

一、目的及要求

组织细胞培养技术要求无菌操作,避免微生物及其他有害因素的影响,因此,了解细胞培养实验室的设置和设备,掌握培养用品的清洗和消毒灭菌是进行试验前的最基本要求。

二、实验原理

利用各种物理(如超声波、高温灭菌等)及化学(如强酸浸泡等)上的方法对去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物,为试验的无菌操作做最初的准备。并用湿热灭菌法对清洗好的细胞培养专用器皿及用具进行消毒。

湿热灭菌法的原理是:湿热法可在较低的温度下达到与干热法相同的灭菌效果,因为:①湿热中蛋白吸收水份,更易凝固变性;②水分子的穿透力比空气大,更易均匀传递热能;③蒸汽有潜热存在,每1克水由气态变成液态可释放出529卡热能,可迅速提高物体的温度。 湿热灭菌法一般采用121℃,灭菌20-30min,如果是产孢子的微生物则应采用灭菌后适宜温度下培养几小时,再灭菌一次,以用于杀死刚刚萌发的孢子。

三、细胞培养室的设置及设备

1.细胞培养实验室的设置

a) 无菌操作区:无菌操作室,净化工作台,无菌操作箱

b) 孵育区

c) 制备区

d) 储藏区

e) 清洗和消毒灭菌区

2.细胞培养实验室的设备

⑴仪器:

a) 显微镜

b) 培养箱

c) 冰箱

d) 细胞冻存储存器

e) 离心机及天平

f) 灭菌锅

g) 干燥箱

h) 水纯化装置

⑵培养用器皿

a) 培养器皿:培养瓶,培养皿,多孔培养板

b) 培养操作有关的器皿:储液瓶,吸管,加样器

⑶器械

细胞原代培养所需的手术剪刀、器械

四、实验步骤

1 培养用品的清洗

1.1 玻璃器皿的清洗步骤:

用毛刷沾取适量洗涤剂刷洗(或用超声清洗仪清洗)用自来水将洗涤剂冲洗干净 1

用自来水冲洗至无色用自来水冲洗,倒掉蒸馏水冲洗3遍超纯水(18.2兆欧)冲洗2

1.2 胶塞、盖子等橡胶、塑料制品的清洗

用毛刷沾取适量洗涤剂刷洗60℃30min 次用超纯水(18.22遍烘干

1.3 Decon90清洗法:将Decon90用去离子水稀释至2%到5%的浓度,依据污渍顽固性程度酌情增加溶液浓度,再将待清洗物浸泡2-24小时,加热(40-50摄氏度)使用超声波清洗池清洗30 min,用自来水冲洗干净,然后用超纯水(18.2兆欧)冲洗3遍,在60摄氏度恒温箱中烘干。

2 包装

a) 将镊子、金属器械、大枪头直接装入铝制饭盒,用胶带将饭盒盖的边缘封住。 b) 将装满蓝枪头、黄枪头的枪头盒用报纸包扎好。

c) 装PBS的蓝口瓶用锡纸将盖包住,尤以与瓶颈结合处应包好。

3 消毒灭菌

3.1 湿热消毒

使用高压蒸汽灭菌器进行消毒。加热升压之前,打开排气阀门,使加热后消毒器内的残

6留冷气排出。在10Pa,121℃条件下消毒20min。消毒完毕后待至压强降于0 Pa后,打开阀

门放气,再打开消毒锅盖。

3.2紫外线消毒

主要用于实验室房间里的空气、操作台表面及桌椅等消毒。通过紫外线照射将微生物杀死。

3.3过滤消毒

通过过滤将用于组织细胞培养使用的液体中的杂质及微生物去除,并能防止培养液因高温消毒而变质。

3.4净化工作台的消毒

用75%酒精擦洗台面,紫外灯照射30-50min灭菌,用75%酒精擦洗台面,关闭灭菌灯后应启动风机运转2min后再进行培养操作。

3.5培养箱的定期维护

由于同学们的操作能力有限,教学实验室的培养箱常年受到污染的困扰。湿式培养基是主要的污染源,应定期移去内容物,包括所有的价值、托盘嗯都需要作彻底清洁,并用无毒的去垢剂,如Decon或Roccall彻底清洗培养箱内部、架子和隔板,然后用70%乙醇清洗去垢剂残迹,待乙醇完全挥发后,再把隔板和培养物放回。

可以把杀真菌剂,如2%

2

五、注意事项

a) 因强酸具有强烈的腐蚀性,在捞取时应带上长至上手臂的超厚橡胶手套(每次使用

前都要检查是否有漏洞),轻拿轻放,防止溅射。

b) 每次用洗涤剂初清洗,烘干后再浸酸,是为了防止器具上的水分将酸稀释,影响清

洁效果。

c) 可用网兜将同类器皿装在一起再浸泡,兜口系好。系口的绳露于浸泡桶外,方便捞

取。

d) 超纯水可接在盆里,多次润洗,以节约资源。

e) 用过的超纯水接在盆里,可清洗其它培养细胞用的器具。使用后的水可用于高压灭

菌锅用水。

附表

强酸配方

重铬酸钾:63g

浓硫酸:1000ml

蒸馏水:200ml

Decon90:

一种高级表面活性清洁剂和放射性污染净化剂,可用于实验室、医疗及专门工业的各种用途。Decon90以非黏性浓缩液体形式提供、可用水进行稀释,可生物递减分解、完全可清洗且不易燃烧。公认的高级实验室清洁剂,在实验室清洁应用中成功的代替了铬酸混合清洁剂。迪康90避免了储存、处理、使用和处理腐蚀酸的各种危险,为实验室始终保持可靠的清洁度提供了理想的解决方法。

1. 不包含磷酸盐、酶、乙二铵醋酸/氮川三醋酸(EDTA/TNA)或含氯漂白剂。

2. 阴离子与非离子表面活化剂、稳定剂、碱、非磷酸盐洗涤促净剂和分隔剂合成的水

基乳剂而产生一种碱性的浓缩物(pH值13+)。

3. 用于玻璃制品、陶器制品、塑胶制品(非聚碳酸脂)、橡胶制品、不锈钢制品铁质

金属制品的完全清洗和/或污染净化、安全有效

4. 作为碱性物质,Decon90不适用于非铁金属制品、特别是铝锌制品,也不适用于聚

碳酸脂制品(迪康中性洗涤剂适用于非铁金属制品及聚碳酸脂制品)。

使用方法:

1. 用去离子水将Decon90稀释调配成浓度为2%至5%溶液。

2. 将待清洗物浸泡2至24个小时,浸泡时间依污渍的顽固性及程度而定。

3. 清洗严重污染物需增加溶液浓度。

4. 加热溶液(40至50摄氏度)或使用超声波清洗池,可以大大缩短清洗时间。

3

5. 清洗物从溶液中取出后,应立即彻底漂洗。清洗物切勿搁置太久再漂洗。用去离子水漂

洗三次,以确保完全清除污染物和清洗剂的残留痕迹。

6. 烘干。

认识一些实验器材及耗材

15ml 离心管,进口品牌能保证无菌、无热源、无RNA/DNA酶。国产耗

材不能保障使用材质及质量。推荐品牌Corning,BD Falcon,NUNC等

50 ml离心管,进口品牌能保证无菌、无热源、无RNA/DNA酶。国产耗

材不能保障使用材质及质量。推荐品牌Corning,BD Falcon,NUNC等

冻存管(2 ml),细胞冻存液的主要储存容器,能耐受-196℃低

温的聚丙烯制成,有硅胶环以保证密封

单道及多道移液器,是细胞及分子实验的主要工具。准确定量

液体很重要,所以要注意定期校准。同时需要注意每次使用后要将移液器调整至最大量程!推荐品牌:eppendorf,Rainin,Glison,biohit

蓝枪头,1ml

常见品牌:axygen,eppendorf,rainin 黄枪头,200 ul白枪头,10 ul

细胞培养瓶

4

多孔培养板,常见为6,12,24,96孔板,无论为

几孔培养板均总需12ml细胞悬液(故6孔板每孔为2ml细胞悬液,96孔每孔为125ul细胞悬液)

实验二光学显微镜的原理和应用

一实验目的及要求

在科研工作中,显微镜是必不可少的基本工具之一,特别是在细胞生物学、组织病理学等学科中发挥了极其重要的作用。因此有必要熟练掌握各种显微镜的基本原理及操作。本次试验的要求主要有:

1 掌握倒置相差显微镜的原理、用途和使用方法。

2 熟悉荧光显微镜的原理、用途和使用方法。

二实验原理

1 倒置相差显微镜的工作原理

波长、频率、振幅、相位是所有波的四种基本属性。在人的视觉中,可见光波的波长(及频率)的变化,表现为颜色的不同,振幅变化表现为明暗的不同,而相位变化肉眼是感觉不到的。当光通过透明的活细胞时,虽然细胞内部结构厚度不同,但波长和振幅几乎没有改变,只是相位有了差别,所以用普通的光学显微镜无法看清未经染色的活细胞的内部细节。 相差显微镜(phase contrast microscope)利用光的衍射和干涉特性,在普通光学显微镜中增加了二个部件:在聚光镜上加了一个环状光阑,在物镜的后焦面加了一个相板,从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此,可以用来观察无色透明活细胞中的细节。

倒置显微镜(inverted microscope)的光学原理与普通光学显微镜原理基本相同,它们之间主要差别是倒置显微镜的光源安装在标本的上方,物镜装在标本的下方,因此,可以用来观察生长在培养瓶皿底部的细胞状态。

倒置相差显微镜,是相差显微镜和倒置显微镜的结合,即既具有倒置显微镜的倒置观察方式,同时,成像原理则与相差显微镜成像原理相一致。当同一种光通过细胞时,由于细胞不同部分对光的折射率不同,因此,通过细胞的光线和未通过细胞的光线便可以产生相位差。再通过特定的相差板使之发生干涉,如果衍射光线和0-级光线相位相反,则合光的振幅减小,物体图像变暗;如果相位相同,则合光的振幅增大,图像变亮,则可以产生明暗不同的图像。因此,无色透明的样品在显微镜下表现出明暗的对比从而可以被识别。

2荧光显微镜的工作原理

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荧光显微镜(fluorescence microscope)是利用一定波长的光激发标本产生不同颜色的荧光,再通过物镜和目镜的放大作用来显示标本中的某些化学成分和细胞组分的显微装置。

某些物质受紫外线照射时可发出荧光,这种物质称荧光物质。细胞内含有少数天然荧光物质,如维生素、脂褐素、核黄素等,经紫外线照射后可自发荧光。还有些细胞成分虽然受照射后不发荧光,但可以与某些荧光物质,如酸性品红、甲基绿、吖啶橙等结合,经紫外线照射后可诱发出荧光。荧光显微镜就是根据这一现象而设计的显微放大装置,可以观察到这些荧光物质在细胞内的分布位置。

三实验器材

1实验仪器:倒置相差显微镜,荧光显微镜

2实验材料:人肺癌细胞A549(协和细胞中心)、PI (Sigma)、DAPI (Beyotime)

四实验步骤

1倒置相差显微镜的使用

将培养好的A549细胞从37

的增加屈光度,老花则减少屈光度)节孔径光栅及光源大小,并判断细胞生长状况 2荧光显微镜的使用

打开电源开关,当电压表的指针稳定在220 V10min),光线进入光路

2、3、4台上,选25×对照组、经DAPI染色后细胞的形态

五实验结果

1.倒置相差显微镜观察结果

A549细胞在显微镜下呈半透明的纺锤状(×400)。

2.荧光显微镜观察结果

经PI染色的细胞发红色荧光(×400);经DAPI染色的细胞核发蓝色荧光(×400);对照组(未经任何荧光染料染色)在显微镜下只看到模糊影像。

6

六结果分析

1. 在倒置显微镜下,胞质越透亮说明细胞的营养状况越好。

2. 对照组虽未进行染色,但由于存在自发光现象,故可看到模糊的影像。

3. 碘化丙啶(propidium iodide,PI)不能穿过完整的活细胞膜,即正常细胞和凋亡细胞在不

固定的情况下对PI拒染,而坏死细胞由于失去膜的完整性,PI可进入细胞内与DNA结合,其染的是细胞核,在绿色光源(535nm)激发下发红色荧光(615nm)。

4. DAPI为4’,6二脒基-2-苯吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole)能与双链DNA小槽,特

别是AT碱基结合,也可插入少于3个连续AT碱基对的DNA序列中。当它与双链DNA结合时,荧光强度增强20倍,而与单链DNA结合则无荧光增强现象,因此是一种简易、快速和敏感地检测DNA的方法。DAPI的荧光强度虽较Hoechst低,但荧光稳定性优于Hoechst;其特异性较溴化乙啶(ethidlium bromide,EB)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)高。在紫外光(340nm)激发下发蓝色荧光(488nm)。

七荧光显微镜使用的注意事项

1. 在光线尽量暗的环境下进行观察

2. 观察对象必须是可自发荧光或已被荧光染料染色的标本。

3. 载物片、盖玻片及镜油应不含自发荧光杂质。

4. 选用效果最好的滤片组。

5. 荧光标本一般不能长久保存,若持续长时间照射易淬灭。因此,如有条件则应先照相存

档,再仔细观察标本。

6. 启动高压汞灯后,不得在15min内将其关闭,一经关闭,必须待汞灯冷却后方可再开

启。严禁频繁开闭,否则,会大大降低汞灯的寿命。

7. 若暂不观察标本时,可拉阻光光帘阻挡光线。这样,即可避免对标本不必要的长时间照

射,又减少了开闭汞灯的频率和次数。

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实验三细胞传代培养

一实验目的及要求

1. 了解细胞传代的一般方法和步骤。

2. 进一步熟悉培养过程中的无菌操作技术。

二实验原理

1. 当培养的细胞增殖达一定密度后,细胞的生长和分裂速度逐渐减慢、停止(出现密度抑制现象),如不及时进行分离再培养(传代),细胞将逐渐衰老死亡。将培养的细胞从一个容器以1:2或其他比率转移到别的容器中扩大培养,称为传代培养。

2. 大多数细胞在体外培养时能贴附在支持物表面生长,称贴附型生长细胞。少数种类的细胞在培养时不贴附于支持物上,而呈悬浮状态生长(如某些癌细胞和血液白细胞),称悬浮型生长细胞。在体外这两种不同生长类型的细胞传代方式不同,贴附型生长细胞用酶消化法传代,而悬浮型生长细胞用直接传代法或离心法传代。

三实验用品

1. 仪器:倒置相差显微镜,试管,移液枪,真空泵

2. 试剂:DMEM低糖细胞培养液(泰格美),0.25%胰酶+0.2%EDTA(泰格美),PBS(自配)

3. 材料:A549细胞(协和细胞中心)

实验前需要准备工作

1.长头发的同学需要束紧长发于脑后,用洗手液洗手和胳膊1min(理论要求2min以上)

2.无论是否带乳胶手套,都应经常用70%乙醇消毒双手(严谨而言,使用过手套需要使用高压灭菌后废弃),脱掉手套后要彻底洗手

四实验步骤

将所需的实验耗材及饭盒放入超净台,超净台内只放入本次实验所需物品,保证试验台的干净整洁,以紫外线照射20min

时间到时,将通风打开,通风5min后,点燃酒精灯,将耗材放在自己顺手的位置,避免实验时需要伸手去伸够物品!在酒精灯附近空出一个操作环境。检查实验所需物齐备后才能开始实验!饭盒内的物品只能用镊子夾取,枪头盒随用随关,不可长时间暴露

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1.洗细胞取已长成或接近长成致密单层的细胞,倒去培养液,加入2ml PBS(或没有Ca2+,

Mg2+的其他缓冲溶液),轻轻振荡漂洗细胞后倾去,以去除残留的血清(血清能抑制胰蛋白酶的细胞活性)和衰老脱落的细胞及其碎片。

2.

加入1ml 0.25%胰蛋白酶(/EDTA)溶液,轻摇,确保酶液浸润过所有细胞层后将其吸出,室温下消化2~3min后,倒置相差显微镜下观察细胞单层,待细胞成片地收缩,出现许多空隙时说明消化程度达到要求(如程度不够可适当延长时间)

3.制备悬液在培养皿中加入1ml培养液,以终止消化。用枪反复吹打皿壁上的细胞层,

直至全部细胞被冲下,轻轻吹打混匀,制成单细胞悬液。

4.接种在新皿中加入2ml DMEM培养基后,将所制细胞悬液全部转移至新皿中,完成1

传1,在皿盖上做好标注。

5.培养将新皿置于37℃恒温箱中进行培养。

6.传代后,每天应对培养细胞进行观察,注意有无污染、培养液的颜色变化、细胞

贴壁、生长情况等。

五实验结果

两天后取出传代的细胞置于倒置显微镜下镜检,可看到(×40)

1. 细胞铺满整个皿底,形成了致密的细胞层,无污染现象。

2. 培养基颜色变浅。

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六结果分析

细胞生长需要大量的营养,而在一周的培养的时间内未及时更新培养基,使繁殖后产生的大量细胞在营养供给上存在严重不足,不少细胞被“饿”死。细胞呼吸产生的CO2改变了培养基pH值,培养基中的指示剂颜色也随之改变。

七注意事项

1. 洗细胞时,将皿稍微倾斜,从侧壁缓缓加入PBS缓冲液。

2. 消化时应勤镜检,防止消化过度,当细胞在视野中由透亮的纺锤形变成小、圆的状态时,

说明达到要求的消化程度。

3. 当达到实验要求的消化程度时,应尽快向皿中加入培养液,使消化终止。

4. 制备细胞悬液时,应尽量减少泡沫的产生,因泡沫破裂产生的表面张力容易破坏消化后

脆弱的细胞。

5. 在制备细胞悬液的过程中,每次吹打时不将所有的液体全部打出。在枪头里留上小部分

的液体再吸培养基,这样可以有效地减少泡沫的产生。

6. 在任何时候都不能把液体从一个无菌容器倒入另一个,倾倒的主要危害是产生了连接试

剂瓶内外的液体桥,这可能会是污染物进入容器!

附图:

消化到正好的细胞(Eahy926,供参考)

附悬浮培养的细胞传代方法

1. 待细胞生长密集,轻轻地将悬浮培养的细胞从培养箱中取出而不要晃动,此时细胞沉降

在瓶的地步。去掉1/3的旧液,加入等量的预热好的培养液。如果培养液的体积小于15ml,轻轻地晃动培养瓶使细胞悬浮,然后水平放入培养箱。

2. 在不需要更换培养液的培养期内,只需摇动培养瓶使细胞悬浮,观察培养液的颜色的变

化,它直接显示细胞生长代谢状况。

3. 当细胞生长到2.5x106个/ml时进行传代。从培养箱中取出培养瓶,摇动以重悬细胞。将

一半的细胞悬液移入一个新培养瓶中,每瓶再补加预热的培养液7-10ml,然后放入培养箱。

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附DMEM培养基的主要成分

附培养器皿的特性

附录:确定和控制细胞培养的微生物污染

细菌和真菌污染可以利用细菌、真菌和酵母生长的条件下直接培养而检测。同样,检测支原体污染的直接方法也可用微生物培养基促使支原体繁殖,再进行筛查。微生物的污染能够通过使用抗生素而得到控制。

细菌和真菌污染的检测 材料

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细菌检测用的培养基:如心脑浸出液,液体巯基磺酸培养基,HTYE肉汤,大豆/酪蛋白消化肉汤

无菌,去纤维蛋白羊血

细胞培养检测样本

10MΩ以上电阻率的纯水

试管、平皿

实验

a.将微生物培养基灭菌

b.灭菌完成后,如不为肉汤需要制备琼脂平板则将培养基于近50℃水下冷却。冷却后在无菌条件下加入去纤维蛋白羊血,分装至平皿。质检通过后备用 c.吸取待检细胞培养基上清5ml。如培养基含有抗生素,需洗涤细胞,2000g离心20 min,去掉上清,用不含抗生素的培养基重悬沉淀。需重复3次以彻底去除抗生素对结果的干扰

d.每一份待测样本,取0.3ml细胞悬液进行接种(2管心脑浸出液,2管液体巯基磺酸培养基,2管HTYE肉汤,2盘大豆/酪蛋白消化肉汤平板,2盘YM琼脂,2盘Sabouraud葡萄糖琼脂

e.培养

f.14天内每天检查结果

g.污染检测阳性者,这将细胞用的制备物进行高压灭菌后废弃

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实验四细胞冻存

一实验目的及要求

培养细胞的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费;而且细胞一旦离开活体开始体外培养,它的各种生物学特性都将逐渐发生变化,并随着传代次数的增加和体外环境的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费,减少污染,减少细胞生物学特性变化。

1. 掌握细胞冻存的基本原则。

2. 熟悉细胞冻存的基本过程。

二实验原理

在不加任何条件下直接冻存细胞时,细胞内外环境中的水会形成冰晶,导致细胞内发生一系列变化,如机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH值改变、蛋白质变性等,导致细胞死亡。但如果在培养液中加入保护剂如甘油或二甲基亚砜 (DMSO),可使冰点降低,在缓慢的冻结条件下,使细胞内水分在冻结前析出细胞外,可使细胞免遭损伤。 细胞冻存的原则:慢冻。当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反,结晶就大,大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。

三实验用品

1. 仪器与用品:倒置相差显微镜,离心机,移液枪,真空泵,试管,冻存管

2. 试剂:DMEM低糖细胞培养液(泰格美),0.25%胰酶+0.2%EDTA(泰格美),PBS(自配),DMSO(北京化工厂)

3. 材料:A549细胞(协和细胞中心)

四实验步骤

取对数生长期的细胞,移除培养基

使用2ml PBS液洗细胞2遍

用1ml胰酶进行消化,镜检,当达到消化要求后,加入1 ml新的培养基终止消化 将终止消化的培养基弃去,加入1 ml新的培养基制备成细胞悬液

将悬液转移至5 ml离心管中,平衡后1000rpm离心3 min;

在等待离心的同时配制冻存液(一人配制5 ml,四人共用;4.5 ml完全培养基 + 0.5 ml DMSO)

取离心好的细胞,弃上清,加入1 ml冻存液,吹打成悬液

将悬液转移至冻存管中,在管壁上标记

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在4℃环境中放置10 min

-20℃中放置30 min

封上封口膜,置于-80℃冰箱中保存

五注意事项

1. 细胞是否处于对数生长期可通过测OD 值进行判断。

2. DMSO可直接在超净工作台中吸取(避免与瓶口、瓶壁触碰)后加入培养液中配成冻

存液,因微生物不会在DMSO中生长,只要无菌操作得当,不会发生污染。

3. DMSO是有机溶剂,不可与橡胶接触。另外,使用时要避免与皮肤接触,因为它是一

种很强的皮肤穿透剂。

4. -80℃冰箱只能保存细胞3-6个月,若想长期保存需置于液氮中。

介绍两种在细胞冻存中的比较有效、简洁的方法

梯度降温盒,通过添加异丙醇达到重复的 -1°C/分钟的冷却速

率,能够成功进行低温冻存和恢复。可以将细胞冻存管由常温直接放入-80℃中

CELLBANKER 2 是 CELLBANKER? 系列的无血清完全细

胞冻存液,通用于各种动物细胞株。特别配方有效提高细胞存活率和活力。不含动物来源性蛋白,能减少各类病毒、霉菌和支原体等污染,确保冻存细胞安全。适合用于无血清培养细胞和蛋白表达细胞。它具有高安全性,病毒、霉菌和支原体等污染可能性低;细胞存活率高,无批次差异。可直接使用。直接存放于-80度冰箱冻存,无需购置可编程序式降温机。

备注:DMSO也是一种渗透性保护剂,能够降低细胞冰点,减少冰晶的形成,减轻自由基对细胞损害,改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。

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实验五细胞计数及台盼蓝法测定细胞活力

一实验目的及要求

培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好,所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞,由组织中分离细胞一般也要检查活力,以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力,了解冻存和复苏的效果。

1. 学会使用血球计数板,掌握计算每毫升细胞悬液中细胞数目的方法。

2. 掌握台盼蓝测细胞活力法。

二实验原理

当待测细胞悬液中细胞均匀分布时,通过测定一定体积悬液中的细胞的数目,即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。细胞密度=(四个大格细胞总数/4)×104个/ml 常用的细胞活力测定方法如台盼蓝法,在染色过程中,活细胞不被染色,死细胞染成蓝色,从而可以区分死细胞与活细胞。利用细胞内某些酶与特定的试剂发生显色反应,也可测定细胞相对数和相对活力。用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力。

细胞密度=(四个大格细胞总数/4) ×2×104个/ml

细胞活力=活细胞数/总细胞数×100%

血球计数板示意图

三实验用品

1. 仪器与用品:倒置相差显微镜,血球计数板,计数器,1.5mlEP管,移液枪,真空泵

2. 试剂:DMEM低糖细胞培养液(泰格美),0.25%胰酶+0.2%EDTA(泰格美),PBS(自配),0.4%台盼蓝(自配)

3. 材料:A549细胞(协和细胞中心)

四实验步骤

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1.细胞计数

从培养箱中取出DMEM

洗细胞一遍用0.5ml PBS并将盖玻片盖在计数板上将待测细胞悬液稀释 注意:

1) 将待测细胞悬液吹均匀,然后吸取少量悬液沿盖片边缘缓缓滴入,要保证盖片下充满悬

液,注意盖片下不要有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中。 2) 镜下观察,计算计数板四大格细胞总数,压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算:

细胞密度=(四个大格细胞总数/4)×104 个/ml 2.台盼蓝法测定细胞活力

向细胞计数中所制细胞悬液加入0.5ml3min 色后的悬液吹打均匀,

注意:镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力。压线细胞只计左侧和上方的。死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。

五实验结果(举例) 1实验数据

数据二 2 细胞密度

将所得数据分别代入公式细胞密度=(四个大格细胞总数/4) ×2×104个/ml 进行计算得 细胞密度1=71.5×104个/ml 细胞密度2=54×104个/ml

3 细胞活力

将所得数据分别代入公式细胞活力=活细胞数/总细胞数×100% 进行计算得 细胞活力1=78.32% 细胞活力2=79.63%

六注意事项

1. 4%台盼蓝母液配置:称取4克台盼蓝,加入少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100毫升,

用0.22μm的微孔滤纸膜过滤(防止未溶解的染料颗粒影响计数),4℃保存。使用时,

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2.

3.

4.

5.

6.

7.

8. 用PBS稀释母液至0.4%即可。 进行细胞计数时,要求悬液中细胞数目不低于104个/ml,如果细胞数目很少要进行离心再悬浮于少量培养液中。 操作时,注意盖片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边槽中,且必须是一次恰好加到合适的量,否则均要重新准备样品。 死细胞能被台盼蓝染上色,镜下可见深蓝色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状。 显微镜下计数时,只数完整的细胞,遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算。如果细胞团>10%,说明细胞分散不充分,需重新制备细胞悬液,否则影响计数准确性。 如果细胞压在格线上时,则只计上线,不计下线,只计右线,不计左线。 计算细胞密度时应注意别忘了乘上稀释倍数。 台盼蓝染色的是死细胞而不是活细胞,是因为死细胞的膜上有孔隙,能让大分子的染料

分子进入。

现在也有细胞计数器可以使用,更加高效便捷

17

实验六 MTT比色法测定细胞相对数和相对活力(6学时)

一、实验目的

活细胞计数法测定细胞数量和活力的方法不仅费时而且有一定的主观性。因此,在对细胞进行药物敏感性实验或是生物材料毒性作用等实验时,一般采取测定细胞相对数和相对活力的方法。MTT比色法就是其中最为常用的一种方法,其操作简便,灵敏度高,重复性好。

二、实验原理

噻唑兰,简称MTT,可透过细胞膜进入细胞内,活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中,其量与细胞数呈正比,也与细胞活力呈正比。结晶物能被二甲基亚砜(DMSO)溶解,用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定其光吸收值,可间接反映细胞数量。

三、仪器、用品和试剂

1. 仪器与用品:细胞培养箱、96孔板或其它孔板、酶联免疫检测仪、普通显微镜、血球计数板、吸管

2. 试剂:DMEM低糖细胞培养液(泰格美),0.25%胰酶+0.2%EDTA(泰格美),PBS(自配),H2O2,MTT(以PBS配制成5 mg/ml,抽滤除菌,保存在4?C)、DMSO(二甲基亚砜)

3. 材料:A549细胞(协和细胞中心)

四、实验步骤(实用于贴壁细胞)

1. 收集对数生长期细胞,PBS清洗,弃去,然后加入1ml胰酶消化,弃去酶液,加入1ml培养液,反复吹打,制备细胞悬液。再用吸管吸适量细胞悬液于血球计数板上,进行细胞计数,调整细胞密度为大约104个/孔。取0.8ml细胞悬液,加入7.2ml完全培养基,反复吹打。混匀后用排枪加入96孔板的中间60孔中,每孔100μl,周边的36个孔用100μl的PBS补齐。

2. 置37 ℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁。一般为4~24 h。

3. 配置不同浓度的H2O2,以100% H2O2母液分别配置浓度为0、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%的药物溶液

4. 取出96孔板细胞,弃去旧培养基,分别加入H2O2浓度为0、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%的药物100 μL,每组设定6复孔。然后放回培养箱中孵育30min

5. 按照9:1的比例将DMEM培养液和MTT溶液(5 mg/ml)配置成混合液,使得MTT的终浓度为0.5 mg/ml。

6. 小心吸去各孔内培养液,每孔加入100 ul上述混合液,继续培养1 h。

7. 终止培养,小心吸去各孔内培养液。每孔加入100 ul二甲基亚砜,反复抽吸,使结晶物充分溶解。

8. 在酶联免疫检测仪492 nm处测量各孔的吸光值。

9. 计算抑制率公式:[(对照-本底)-(给药-本底)]/(对照-本底)×100%

五、注意事项

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1. 实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。

对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜,不同的是对照加溶解药物的介质,而加药组加入不同浓度的药物。

2. 每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整,并进行预实验调整浓度,太多敏感

性降低,太少观察不到差异。

3. MTT一般4?C保存两周,注意避光保存,或配制成5mg/ml保存在-20?C长期保存,避

免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解,配制完后可过滤一下。

4. 注意细胞悬液一定要混匀,已避免细胞沉淀下来,导致每孔中的细胞数量不等,可

以每接几个就要再混匀一下。

5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活力,不能测定细胞绝对数。

现在也有MTT的改良产品能应用在实验中

最常见的为:

1.CellTiter 96? AQueous One Solution Cell Assay(MTS)(CellTiter 96? AQueous 单溶液细胞增殖检测试剂盒)

2.Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)

这两种试剂盒与普通的MTT法相比,具有显著特点:

★灵敏度高,数据可靠,重现性好

★操作简便,省时省力

★水溶性,不需要换液,尤其适合于悬浮细胞

★无需放射性同位素和有机溶剂,对细胞毒性低

★适合于高通量药物筛选

用途:药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验

19 Proliferation

实验七冻存细胞的复苏

一实验目的及要求

在实际操作中,冻存细胞要进行复苏,再培养传代。通过本实验学习细胞复苏的方法,并掌握长期保存体外培养细胞的技术。

二实验原理

细胞复苏的原则——快速融化:必须将冻存在-196℃液氮中或-80℃冰箱中的细胞快速融化至37℃,使细胞外冻存时的冰晶迅速融化,避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶,对细胞造成损害。

三实验仪器、用品和试剂

1. 仪器与用品:倒置相差显微镜,血球计数板,离心机,离心管,真空泵,培养皿

2. 试剂:DMEM低糖细胞培养液(泰格美)、台盼蓝染液(自配)

3. 材料:冻存的A549细胞

四实验步骤

将3ml

-80℃水浴中解冻 2000pm2min 培养基将沉淀悬浮,用枪吹打均匀

取50μl 细胞悬液加入50μl台盼蓝染料染色3min 950μl细胞悬液转至已加好培养基的培养皿中,置37℃恒温箱中继续培养

五实验结果(举例)

1 细胞复苏情况

计数结果

将数据分别代入公式得

细胞密度=(四个大格细胞总数/4) ×2×104个/ml=332×104个/ml

细胞活力=活细胞数/总细胞数×100%=98.05%

2 细胞传代情况

培养24h后镜检,发现已贴壁,换取培养基置于37℃恒温箱中继续培养。

六结果分析

1. 从以上数据可看出,此次冰冻及复苏的细胞成活率较高。

2. 传代结果可看出,复苏后的细胞具有较好的活力。

七注意事项

1. 将冻存管冰箱中取出时,要做好防护工作,以免冻伤。

2. 细胞复苏时速度要快,使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃,细胞仍能生长,活力受损 20

不大。

3. 水浴锅一到实验室立即打开,使其升温至37℃并保持恒定,在水浴中解冻时来回震荡冻

存管以帮助更快地化解。

4. 离心的时间要短,因细胞刚解冻,比较脆弱。

5. 最好用新配制的培养液。

实验八细胞凋亡和荧光染色

一实验目的及要求

凋亡是指细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩,表面微绒毛消失,染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘,继而核裂解,由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面,最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。细胞凋亡机制复杂,一般采用多种方法综合加以判断。目前常用的方法有:形态学观察(光镜、电镜、荧光显微镜、倒置相差显微镜)、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞分析、凋亡细胞的原位末端标记(TUNEL)、细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)荧光显示等。

通过本实验需达到以下要求:

1. 熟悉细胞凋亡的原理及检测方法。

2. 熟悉荧光细胞化学的原理及荧光显微镜的原理的使用方法。

3. 熟悉荧光染色法在细胞凋亡中的应用。

4. 观察荧光染料染色后结合物发出的荧光。

二实验原理

细胞凋亡时产生最显著的变化是染色体固缩,DNA 裂解使细胞核形态发生变化。荧光染料Hoechst 33258 是一种无毒、水溶性双苯咪唑类化合物,可作为荧光探针与DNA 分子结合。在凋亡细胞中,细胞膜对Hoechst 33258 的摄取增高,并且由于染色体高度浓缩,Hoechst 33258 与之结合增强,染色呈强蓝色荧光,细胞核会呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染而正常细胞只呈微弱荧光,死细胞则不被染色,由此可检测出凋亡。

荧光细胞化学是利用短波(紫外光等)能激发细胞内荧光物质并在荧光显微镜下呈现荧光影像的原理,对组织细胞的特定物质进行定性、定位、定量观察分析的一种技术。

三实验用品

1. 实验器材:荧光显微镜(Olympus X51),六孔板(corning),移液枪,真空泵

2. 实验试剂:Hoechst 33258(Beyotime),PI(sigma),H2O2(北京化工厂),PBS(自

配),DMEM低糖细胞培养基

3. 实验材料:A549细胞

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四实验步骤

每孔2ml 培养基,将A549细胞在37℃培养箱中培养2d

加入新鲜培养基,每孔分别用100μmol/l、500μmol/l H2O2处理,并留两孔做对照,处理30min 将所有液体吸净,用1ml PBS 300μl Hoechst 33258染色5min 吸净Hoechst 33258 1 ml PBS,静置5min,重复3,镜检

五实验结果

对照组(普通显微镜下,×100)对照组(荧光显微镜下,×100)

细胞凋亡(100μmol/l处理,×100)细胞凋亡(500μmol/l处理,×100)

凋亡小体(100μmol/l处理,×100)凋亡小体(500μmol/l处理,×100)

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凋亡细胞PI染色

六实验结果分析

1、荧光显微镜下,凋亡细胞呈强蓝色荧光,细胞核会呈致密浓染,或呈碎块状致密浓染,而正常细胞只呈微弱荧光。

2、500μmol/l H2O2处理比100μmol/l H2O2处理发荧光的细胞多,说明高浓度的H2O2对细胞的伤害更大。

七注意事项

1、染色时间严格控制,染色过久可导致假阳性即对照组也发荧光。

2、荧光极易萃灭,故荧光染料和染色过程均需避光,且应快速找好目标细胞快速拍照。

3、本次试验直接使用贴壁细胞,故可省略固定这一步,但是保存性不好。

实验九细胞原代培养

一实验目的

原代培养是从供体中取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养不仅是建立各种细胞系的第一步,也是从事组织培养工作人员应熟悉和掌握的最基本的技术。原代细胞的培养具有极其重要的临床意义,如药物筛选、药物代谢和药物相互作用研究、药物毒理学研究、病毒感染细胞模型的建立、理化和毒物因素的影响等。

二实验原理

初代培养又称原代培养(Primary culture)即从供体组织获得组织首次所进行的培养,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,使细胞得以生存、生长和繁殖,一般1-2周后,进行传代培养。细胞刚刚离开供体,其形态、功能状况很近似在体。都具有二倍体细胞遗传特性,代表在体状况。

三实验用品

1. 仪器与用品:倒置相差显微镜显微镜,离心机,试管,移液枪,培养皿,手术刀片,注

射器,眼科剪,真空泵

2. 试剂:DMEM高糖细胞培养液(Hyclone),PBS(自配),0.25%胰酶(碧云天) 3. 材料:成年大鼠(军事医学科学院动物房)

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四实验步骤

1. 按照约50g/kg大鼠为大鼠注射麻醉剂,待其昏迷后,置75%酒精中浸泡3min,剖取大鼠肝脏,置于玻璃皿中,分成小块,剔除脂肪、结缔组织等杂物。

2. 取1ml PBS于培养皿中清洗肝脏组织,洗完后吸去PBS,然后再用1ml PBS清洗一次。

3. 用眼科剪刀反复剪碎肝组织,直至剪成1mm3大小的组织块

4. 加入2ml胰酶消化,放于37℃培养箱中20min。消化十分钟时拿出来摇晃一次。

5. 镜检,待细胞从组织解离。将消化液全部转入10ml离心管中,再加入1ml培养基终止胰酶消化,在2000rpm下离心3min

6. 离心后,用枪吸去上清,加入3ml培养基重新悬浮,静置。

7. 静置后,吸出上清至另一10ml离心管中,在2000rpm下再离心3 min

8. 弃去上清,小心收集离心管底细胞,加入5ml新鲜培养基重新悬浮,接种到新培养皿中,标记后,放于37℃培养箱中培养。

五实验结果

大鼠原代肝细胞

实验十细胞基因组DNA的提取

一实验目的及要求

了解基因组DNA提取的基本原理,掌握苯酚抽提法提取基因组DNA的技术要点, 练习使用苯酚抽提法提取中等长度片段的动物基因组DNA。

二实验原理 真核生物的一切有核细胞(包括培养细胞)都能用来制备基因组

DNA。真核生物的DNA是以染色体的形式存在于细胞核内,因此,制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离,又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出,可得到较大片段的DNA,长度可达Mb级,但该方案的成本较为昂贵,多用于染色体的分离、分析,以及大片段基因组文库的构建等。

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当DNA长度要求在kb级以下时,可采用酚抽提法去除蛋白质成分,在pH8.0的条件下,DNA基本分布于水相中,而变性的蛋白质位于上层水相与下层有机相之间的变性层。苯酚抽提法制备的DNA片段长度上限一般可达到50kb。

三实验用品

1. 实验仪器及器具:速离心机,电泳仪,匀浆器,眼科手术剪,玻璃皿,培养箱,移液枪,

EP管

2. 试剂:抽提缓冲液(10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.1mol/L EDTA (pH 8.0), 20μg/ml 胰

RNA酶,0.5% SDS),Tris饱和酚 (pH 8.0),氯仿/异戊醇(24:1),无水乙醇,90%乙醇,70%乙醇,TE溶液(10mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol/L EDTA)

3. 材料:大鼠内脏

四实验步骤

1. 在玻璃皿内将大鼠内脏尽量剪碎,在匀浆器内加1mL裂解缓冲液,然后移入内脏碎块研

磨成匀浆。

2. 将匀浆移至10mL离心管中,再加2mL缓冲液,放于37℃培养箱中培养1h。

3. 取出离心管,加入3mL饱和酚,然后用封口膜将离心管管口封住,来回轻轻摇5min。

4. 5000g,4℃下冷冻离心15min,然后将黄枪头剪掉1/4后,小心吸取上清移至新的10mL

离心管中。

5. 加入等体积的酚,氯仿/异戊醇,即各加入1.5mL,然后再于5000g,4℃下冷冻离心10min。

6. 离心完后,去上清置于新的10mL离心管中,加入两倍体积(约4mL)的冰冷无水乙醇,

慢慢上下摇动几下,使白色絮状物成团。

7. 小心挑去白色絮状物(基因组),依次500μL90%、70%的酒精中快速漂洗一遍。

8. 将漂洗后的基因组转移至1.5mLEP管中,敞口置于超净工作台中吹干。

9. 乙醇被吹干后,加入50μL TE溶液,小心摇晃待基因组溶解,注意不要用大力把基因组

摇段。

10.制备0.7%的琼脂糖凝胶,取6μL样品上样进行电泳,观察记录电泳结果。

五实验结果

电泳照片

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六注意事项

1. 苯酚对皮肤、眼睛有刺激性,实验中应小心,操作时戴手套,颠倒离心管以及打开离心

管盖时,要防止苯酚溅到皮肤上。

2. 酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)溶液,用于蛋白的变性抽提,酚用于去除蛋白质,氯仿可去除

水相中残留的酚,并且具有稳定离心后形成的分离界面的作用,异戊醇则能抑制蛋白质变性过程中产生的泡沫,并能减小有机相与水相间的表面张力。

3. 若有条件,最好先用RNA酶将其他RNA降解,跑胶时可减少干扰。

4. 将黄枪头剪掉1/4,是为了让枪口大些,尽量避免吸取中间的蛋白。

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