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精减5.1DNA的粗提取与鉴定(动画)

发布时间:2014-02-08 10:46:02  

一、基础知识
(一)提取DNA的方法 1.提取生物大分子的基本思路 选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理 或化学性质的生物大分子 2.生物大分子 主要指蛋白质、酶和核酸 3.提取DNA的基本思路 利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化 学性质方面的差异,提取DNA,去除其他成分

4.DNA的溶解性 DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶 液中溶解度不同,利用这一特点,选择适当的 盐浓度就能使DNA充分溶解,而使杂质沉淀, 或者相反 讨论: ①根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图, 思考在什么浓度下, DNA的溶解度最小? DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的?

在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时,DNA的溶 解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低; 在0.14 mol/L时,DNA溶解度最小; 当NaCl溶液浓度继续增加时,DNA的溶解度又 逐渐增大。 ②如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液 中溶解或析出?
当氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L时,DNA的 溶解度最大. 浓度为 0.14 mol/L时,DNA的溶解度最低。 利用这一原理,可以使DNA在盐溶液中溶解或析 出

DNA在酒精溶液中的溶解性 DNA 不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些物质 则可以溶于酒精。 利用这一原理,可以将 DNA与蛋白质进一步分 离 5.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性.

①蛋白酶能水解蛋白质,但是对DNA没有影响
②大多数蛋白质不能忍受60-80°C的高温, 而DNA在80°C以上才会变性 ③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜,去除脂质和 蛋白质,但对DNA没有影响

6.DNA的鉴定

DNA与二苯胺(沸水浴)会染成蓝色,因此, 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂

二、(DNA的粗提取与鉴定的)实验设计

(一)实验材料的选取
1.材料:鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺 乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、 在液体培养基中培养的大肠杆菌。 (从中选取2~3种实验材料)

2.原则:凡是含有DNA的生物材料都可以考虑, 但选用DNA含量相对较高的生物组织,成功的可 能性更大

(二)破碎细胞,获取含DNA的滤液

1.动物细胞
动物细胞的破碎较易,例如,在鸡血细胞液中 加入一定量的蒸馏水 ,同时用玻璃棒搅拌,过 滤后收集滤液即可 讨论:为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂? 答:蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体, 水分可以大量进入血细胞内,使血细胞胀裂, 再加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的 破裂(细胞膜和核膜的破裂),从而释放出DNA

2、植物细胞 ①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解 细胞膜 讨论:加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?

答:洗涤剂是一些离子去污剂,能溶解细胞膜, 有利

于DNA的释放;食盐的主要成分是NaCl, 有利于DNA的溶解
②实例:提取洋葱DNA时,在切碎的洋葱中加 入一定的洗涤剂和食盐,进行从分的搅拌和研 磨,过滤后收集研磨液

讨论:如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样 的影响?

答:研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全, 提取的DNA量变少,影响实验结果,导致看不到 丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等

(三)去除滤液中的杂质
为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理 讨论:此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞 成分?

答:可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质

讨论:为什么反复地溶解与析出DNA,能够去 除杂质 答:用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高 盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出, 能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反 复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解度 不同的多种杂质

讨论:方案二与方案三的原理有什么不同?
答:方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白,从而 使提取的DNA与蛋白质分开;方案三利用的是 DNA和蛋白质对高温耐受性的不同,从而使蛋 白质变性,与DNA分离

(四) DNA的析出与鉴定 1.DNA的析出 DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒 精溶液(体积分数为95 %) ,静臵2-3min, 溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取DNA。 用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用 滤纸吸取上面的水

2. DNA的鉴定

鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为 2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中,其中一 只加入DNA丝状物,各加入二苯胺4ml 试剂。 混合均匀后,将试管臵于沸水中加热5min,待试 管冷却后,比较两只试管中溶液颜色的变化,看 看溶解有DNA的溶液是否有蓝色

(五)实验案例。 (一)案例一:以鸡血为实验材料进行DNA的 粗提取 1.鸡血细胞做实验材料的原因

①鸡血细胞核的DNA含量丰富,材料易得 ②鸡血细胞极易吸水胀破,而用动物肝脏细胞 作实验材料常常需要匀浆和离心,对设备要求 较高,操作繁琐,历时较长

2.实验原理 3.实验材料和用具:

4.课前准备鸡血细胞液
①过程 取质量浓度为0.1g/ml的柠檬酸纳溶液(抗凝 剂)100ml,臵于500ml烧杯中。注入新鲜的 鸡血(约180ml),同时用玻璃棒搅拌,使血 液与柠檬酸纳溶液充分混合,以免凝血。将烧 杯中的血液臵于冰箱内,精臵一天,使血细胞 自行沉淀。(也可以将血液倒入离心管内,用 1000r/min(转每分)的离心机离心2min, 血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除 去离心管上部的澄清液,就可以得到鸡血细胞 液。)

②柠檬酸钠作用 防止血液凝固 ③作用机理 柠檬酸钠能与血

浆中的Ca2+发生反应,生成柠 檬酸钙络合物,血浆中游离的Ca2+大大减少, 血液就不会凝固 ④注意事项 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA,容易被玻璃 容器吸附,所以在提取过程中为了减少DNA的 损失,最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细 胞液

讨论:提取鸡血中的DNA时,为什么除去血液 中的上清液?
答:血液分为两部分,一部分是血浆,一部分 是血细胞,离心后除去的上清液是血浆

5.方法步骤
①提取鸡血细胞的细胞核物质
②溶解细胞核内的DNA ③析出含DNA的粘稠物 讨论:加入蒸馏水的目的? 降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点,使 DNA从NaCl溶液中析出

④滤取含DNA的粘稠物
⑤将DNA的粘稠物再溶解 ⑥过滤含有DNA的氯化钠溶液 ⑦提取含杂质较少的DNA

⑧ DNA的鉴定

讨论: (1)为什么要加入蒸馏水?加入蒸馏水后细胞 会有什么变化?

答:让细胞内浓度大于周围溶液的浓度,细胞 会吸水以至胀破 (2)用玻璃棒搅拌有什么意义? 答:用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的 破裂。注意应沿一个方向快速搅拌,但也不能 太快太猛,防止打碎DNA (3)滤去的是什么物质?得到的是什么?
答:过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质; 得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA

讨论: (1)为什么要加50mL的冷酒精? 答:因为DNA不溶于冷酒精,而其他物质可以 溶解在酒精中,使含杂质较少的DNA丝状物可 以析出,悬浮于溶液中 (2)观察丝状物呈什么颜色? 答:白色

讨论: (1)比较两个试管中溶液的颜色有什么不同? 答:有丝状物的试管变成蓝色,另一试管还是 原来颜色 (2)这一鉴定结果说明什么问题?

答:提取出的丝状物是DNA
(3) DNA的直径约为20×10-10 m,实验中 出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径 的大小?

答: DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多 个DNA子聚在一起形成的

6.讨论: (1)此实验过程中有几次使用蒸馏水?几次过 滤,几次析出,几次搅拌?分别在哪一步? 答:整个实验共“两次蒸馏水,三次过滤,两 次析出,六次搅拌” ①两次蒸馏水

第一次:细胞吸水胀破 第二次:使 DNA黏稠物析出

第一步 第三步

②三次过滤 第一次: DNA存在于滤液里 第二次: DNA被留在纱布上 第三次: DNA存在于滤液里 第一步 第四步 第六步

过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有 关,第二次要用其滤出的黏稠物有关,所以要 使用多层纱布,第一次和第三次均要用其滤液, 使用的纱布为1-2层

③两次析出
第一次:用0.14 mol/L 的NaCI 溶液含杂质多 第二次:用冷却的95%的酒精 ④六次搅拌:第一、二、三、五、七步 其中除第

八步外,其余均要朝一个方向搅拌, 在第三、五步搅动还要轻缓,玻璃棒不要直 插烧杯底部,这样才能保证得到完整的DNA 第三步 第七步

(2)为什么反复地溶解与析出DNA,能够去 除杂质? 答:用高盐浓度的溶液溶解DNA,能除去在高 盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使DNA析出, 能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过 反复溶解与析出DNA,就能够除去与DNA溶解 度不同的多种杂质

(二)案例二:以菜花为实验材料进行DNA的 粗提取 1、课前准备
将新鲜菜花和体积分数为95%的乙醇溶液放 入冰箱冷冻室24 h 2、提取DNA的具体步骤 ①取材:称取30 g菜花,去梗取花,切碎 ②研磨:将碎菜花放入研钵中,倒入10 mL研磨 液,充分研磨10 min

研磨液的配制方法如下:将10.1 g Tris加入到 50 mL蒸馏水中,使其溶解,然后,用2 moL/L的HCl溶液调节pH至8.0,再加入8.76 g NaCl 、37.2 g EDTA 、20 g SDS。待上述 药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1 000 mL

Tris/HCl:提供缓冲体系,DNA在这一体系中 呈稳定态(Tris为三羟甲基氨基甲烷)
EDTA(乙二胺四乙酸二钠):是DNA酶的抑 制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA SDS(十二烷基磺酸钠):可以使蛋白质变性, 与DNA分离

③过滤:在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨 液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑 料离心管中进行离心,用1000 r/min的转速, 离心2~5 min,取上清液放入烧杯中)。在4 ℃冰箱中放臵几分钟后,再取上清液
④沉淀:将一倍体积的上清液倒入两倍体积的 体积分数为95%的预冷乙醇溶液中,并用玻 璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插 到烧杯底部)。沉淀3~5 min后,可见白色的 DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,将絮 状物缠绕在玻璃棒上

四、结果分析与评价
(一)是否提取出了DNA 观察你提取的DNA颜色,如果不是白色丝状物, 说明DNA中的杂质较多;二苯胺鉴定出现蓝色 说明实验基本成功,如果不呈现蓝色,可能所 提取的DNA含量低,或是实验操作中出现错误, 需要重新制备

(二)分析DNA中的杂质 本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核 蛋白、多糖等杂质 (三)不同实验方法的比较

对于不同的实验方法,本课题可以采用分组的方法进行 研究。首先选取不同的实验材料,其次同种材料还可以 采用不同方法,从多方面比较实验结果,如DNA的纯度、 DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等,看看哪种实验材料、 哪种提取方法的效果更好

五、课题延伸。

一、基础知识。 提取DNA的方法。

课堂小结
1.提取思路。

二、实验设计。 (一)实验材料的选取。4.DNA的不溶解性。5.DNA耐受性。 的鉴定。 (

二)破碎细胞,获取含6.DNA DNA 的滤液。 (三)去除滤液中的杂质。 (四)DNA的析出与鉴定。 1.利用DNA在不同浓度的食 (五)实验案例。 盐溶液中溶解度不同。 2.在滤液中加入嫩肉粉。 三、操作提示。 (木瓜蛋白酶分解蛋白质。 四、结果评价与分析。 3.将滤液放在60—75度恒温 水浴箱保温10—15分钟。 五、课题延伸。

2.生物大分子。3.提取DNA基本思 路。


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