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竞赛2013生化

发布时间:2014-02-04 10:40:14  

2013年竞赛辅导

利用PCR技术扩增目的基因
全称是:多聚酶链式反应,在生物体外复制特定DNA片段 的核酸合成技术。可以在短时间内大量扩增的目的基因。

DNA复制的过程涉及DNA双链的方向。通常将DNA的羟基 (-OH)末端称为3’端,而磷酸基团的末端称为5’端
5’端 3’端

3’端

5’端

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从3’端 延伸DNA链。因此,DNA复制需要引物。当引物与DNA 母链通过碱基互补配对结合后,DNA聚合酶就能从引 物的3’端开始延伸DNA链。
5’
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’

5’
3’ 5’

3’

5’

3’

DNA的合成方向总是从子链的5’端端向3’端端延

复习:DNA复制
DNA复制的过程
1.解旋:利用细胞提供的能量边

解旋、边复制 2.配对:分别以每条单链为模 板,以四种游离的脱氧核 苷酸为原料,利用碱基互 补配对原则合成两条新的 子链 3.螺旋:两条子链分别与对应 的模板链绕成螺旋型,构 成两个新的DNA分子

DNA复制方式:半保留复制

思考: ? DNA复制需要哪些成分和反应条件? ? 如何在体外设置一个类似的DNA复制环境?
参与的组分 解旋酶 DNA母链(模板链) 4种脱氧核糖核苷酸 DNA聚合酶 在DNA复制中的作用 打开DNA双链 提供DNA复制的模板 合成子链的原料 催化合成DNA子链 使DNA聚合酶能够从3’端开始连接脱 氧核苷酸

引物

PCR技术依据的原理:
DNA双链复制的原理(遵循碱基互补配对原则) DNA热变性的原理 前提条件:有一段已知目的基因的核苷酸序列 基本条件:
? 含待扩增目的基因片段的DNA模板; ? 根据目的基因双链各一端序列片段合成 与两条模板链相结合的两种引物; ? 要有耐热的DNA聚合酶(Taq酶); ? 四种单核苷酸(dCTP、dGTP 、dATP 、dTTP )。

PCR第一轮过程:
变性 复性
55-60℃

延伸

1.DNA变性:加热至9095℃, DNA片段受热后氢 键断裂,形成单链; 2.复性:冷却至55-60℃, 引物结合到互补DNA链; 3.延伸:加热至70-75℃, 耐热的DNA聚合酶从引物 起始引导互补链的合成。

结果:使目的基因在短时间内成百万倍的扩 增 目的基因以指数方式扩增,即2n

基础知识
? 分离不同种类蛋白质的原理: 利用分子的形态和大小、所带电 荷的性质和多少、溶解度、吸附性 质和对其他分子的亲和力。

1、凝胶色谱法
? 原理:根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 ? 凝胶: 微小的多孔球体。如:葡聚糖、琼脂糖

1、凝胶色谱法
? 原理:根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。 ? 凝胶: 微小的多孔球体。如:葡聚糖、琼脂糖

分子量大的分子通过 多孔凝胶颗粒的间隙, 路程短,流动快;分 子量小的分子穿

过多 孔凝胶颗粒内部,路 程长,流动慢。

1、凝胶色谱法
(3)分离过程: 混合物上柱 洗脱

大分子流动快、 小分子流动慢

大 分子 收集____
收集____ 小 分子

3、电泳
? 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移 的过程。

? 原理:是在电场的作用下,利用待分离样品 中各种分子带电性质以及分子本身大小、形 状等性质的差异,使带电分子产生不同的迁 移速度,从而达到对样品进行分离、鉴定或 提纯的目的。

(2)分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰 胺经胶电泳等。 (3)分离过程: ?在一定pH下,使蛋白质基团带上正电或负电; ?加入带负电荷多的SDS,形成“蛋白质-SDS 复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子大 小。 ?测定蛋白质分子量时,常使用SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳

离子交换层析

凝胶过滤层析

亲和层析

单 克 隆 抗 体 制 备 过 程

在生物化学反应中,当底物与酶的活性位点形成互 补结构时,可催化底物发生变化。酶抑制剂是与酶结 合并降低酶活性的分子,其中竞争性抑制剂与底物竞 争酶的活性位点,从而降低酶对底物的催化效应;非 竞争性抑制剂和酶活性位点以外的其他位点结合,能 改变酶的构型,使酶不能与底物结合,从而使酶失去 催化活性。

竞争性抑制剂

非竞争性抑制剂


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