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核型分析

发布时间:2013-10-20 10:41:38  

人外周血淋巴细胞的分离培养及核型分析

一、实验目的

1.学习人体微量外周血分离培养的方法

2.学习应用培养淋巴细胞进行染色体制片的方法

3.了解人类染色体核型的基本特征

4.通过对人类染色体组型进行分析,初步学会对染色体进行分析的方法。

二、实验原理

人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板,其中红细胞和血小板不能离体培养,白细胞中含有小淋巴细胞。外周血是制备动物染色体标本的重要材料之一。通常情况下哺乳动物外周血中是没有分裂相的,只有在异常情况下才能发现,其他动物如两栖类外周血中也只是偶尔能见到分裂相。外周血中的小淋巴细胞几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态。在人工离体培养时,在培养基中加入一定剂量的植物血凝素(PHA)后,小淋巴细胞受刺激可转变为淋巴母细胞,重新进入增殖周期,进行有丝分裂。外周血中的淋巴细胞经过68-72小时(三个周期)的短期培养,即可产生大量的增殖期细胞群。用秋水仙素(细胞分裂阻断剂)处理,积累分裂相,可使处在分裂期的淋巴细胞停留在分裂中期或早中期,从而获得足够的可供分析的中期分裂相。此外,秋水仙素还能使染色单体缩短、分开,使染色体呈现明显形而利于辨认。

核型分析是指在有丝分裂中期,对染色体大小形态、数目测量,进行排队分组分析。不同物种的染色体都有各自特定的形态结构(包括染色体的长度、着丝点位置、臂比、随体大小等)特征,而且这种形态特征是相对稳定的。在显微镜下观察染色体的结构和数量。正常男性的染色体核型为44条常染色体加2条性染色体X和Y。正常女性的常染色体与男性相同,性染色体为2条XX。

三、实验仪器与试剂

1. 实验材料:

人外周血淋巴细胞

2.实验试剂

RPMI“1640”培养基 、小牛血清(冰冻保存,用时在56℃水浴条件灭活)、肝素、生理盐水溶液(500U/ml)、5%NaHCO3、秋水仙素、植物血球凝集素(PHA)、

双抗(青霉素:50000U/ml,链霉素:50000ug/ml)、2%碘酒、pH6.8的磷酸缓冲液、75%酒精、0.075mol/L KCl、固定液(甲醇:冰醋=3:1)、Giemsa原液。

3.实验器材:

电子天平、移液管、量筒、烧杯、试剂瓶、培养瓶 、毛细吸管、采血针、离心机、离心管、酒精灯、显微镜、载玻片、超净工作台、37℃恒温培养箱、无菌注射器(1ml、2ml、5m1)、橡皮塞、75%酒精棉球、止血带、试管架、毫米尺、计算器

四、实验步骤与方法

(一)人外周血淋巴细胞的分离培养

1、培养基的分装

在超净工作台内,用量筒取 RPMI“1640”培养基40m1、牛血清10m1,用1m1注射器取肝素0.3m1、PHA 0.4m1、双抗0.3m1。混匀后,用5%NaHCO3调节PH至7.2。

用5m1移液管分装入20m1培养瓶,每小瓶5m1,盖紧皮塞,胶布封口备用。

2、采样接种

用肥皂洗净供血者的手,再用2%碘酒、75%酒精擦拭指尖消毒,待酒精完全挥发干后,无菌条件下用无菌采血针刺破指尖,吸取外周血0.3-0.4ml,移入培养瓶,轻轻摇匀,尽量避免培养物与瓶盖接触。

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3、培养

置37℃培养箱中培养72小时,每隔12小时左右轻遥1次,以促进细胞生长增殖。

4、秋水仙素处理

培养终止前6-10h左右加秋水仙素,培养液最终浓度为0.02ug/ml,摇匀后置培养箱中继续培养(以抑止细胞分裂,使细胞停留在分裂中期)。从培养箱中取出培养瓶,摇匀后移至10ml尖底离心管中,离心8min,2000r/min,尽量收集培养细胞。

5、低渗处理

离心后弃上清液,加入8ml预温37℃的0.075mol/L KCl,迅速摇匀,置37℃培养箱中10-20分钟,使红细胞破碎,白细胞膨胀。

6、收集白细胞

1000r/min离心5分钟,用吸管吸去全部上清液及沉淀上层较透明的部分,收集白细胞。

7、固定

沿管壁慢慢加入新鲜配制的固定液5ml,吸管吹打混匀,固定20分钟。 1000r/min离心5分钟,弃去上清。再加入固定液5mL,用吸管轻轻打散,室温中继续固定15min后以1000r/min离心5min, 弃去上清液,留下白细胞制片。

8、制片

视离心管底细胞多少加入少量新鲜固定液,吹打成均匀悬浮液。取洁净冰水中预冷的载玻片,稍作倾斜,用吸管吸取一滴上述细胞悬浮液,与载玻片上方适当高度滴在载玻片上,立即吹散吹匀载玻片上细胞,置空气中凉干。

9、染色

载玻片充分干燥后,用PH为6.8的磷酸缓冲液按一份Giemsa原液,九份磷 3

酸缓冲液混匀后染色。材料面向上,用染液覆盖载玻片,染色10-15分钟,用吸水纸吸取多余水分,干燥后即可镜检。

10、镜检

低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相,再在油镜下观察,选择染色体清晰,分散度好的细胞进行核型分析。

(二)核型分析

1、制备好的人外周淋巴细胞装片放到显微镜下,先用低倍镜寻找染色体分散良好的中期分裂相转换油镜仔细观察。

2、观察2~3个分裂相,并寻找10个分散良好的分裂相进行染色体计数并拍照。

3、将一张正常人中期分裂相照片分析,仔细辨认每条染色体,并用铅笔在其旁边注明序号或组别,先找出A、B、D、E、F、G组,最后辨认C组。

4、将照片上的染色体逐个剪下,使短臂朝上,长臂朝下,依次排列在预先划分好了分组横线的报告单上,并使着丝粒于一条直线上,校对调整。

5、用牙签挑取少许胶水小心地将每号染色体都依次贴在报告单上。

6、分析结果:辨别该核型的性别,并记录核型。

五、实验记录

人的一个典型的中期细胞染色体都已纵裂成2条染色单体,称姐妹染色单体,由一个着丝粒相连。每条染色体以着丝粒为界可分为长、短两个臂。根据着丝粒位置的不同,可将人类的染色体分为中部着丝粒染色体、亚中部着丝粒染色体、近端着丝粒染色体和端部着丝粒染色体四类。

46条染色体中的44条男女共有的常染色体分配成A、B、C、D、E、F、G七个组。对于另外的一对性染色体也根据形态大小归类,X染色体归到C组。Y染色体归到G组。人类染色体分组与形态特征见表1。

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表1 人类染色体分组与形态特征

组 别 染色体编号 大小 着丝粒位置 随体

A 1~3 最大 中央着丝粒(1、3号) 无

亚中央着丝粒(2号) 无

B 4~5 次大 亚中央着丝粒 无

C 6~12;X 中等 亚中央着丝粒 无

D 13~15 中等 近端着丝粒 有 E 16~18 较小 中央着丝粒(16号) 无

亚中央着丝粒(17、18号) 无

F 19~20 次小 中央着丝粒 无 G 21~22;Y 最小 近端着丝粒 21、22有 Y无

六、实验结果与讨论

染色体是遗传物质的载体,存在于分裂间期细胞的细胞核内。每一个体细胞含有两组染色体组,一组来自父方,一组来自母方,用2n表示。其中与性别直接有关的染色体,即性染色体,可以不成对。人类每个体细胞有46条染色体,22对常染色体和一对性染色体,男子是46,XY;女子是46,XX。

染色体在复制以后,纵向并列的两个染色体,往往通过着丝粒连在一起。着丝粒在染色体的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同,可以把染色体分成相等或不等的两臂,造成中间着丝粒,亚中间着丝粒,亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。此外,有的染色体还含有随体和次级缢痕。所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。染色体的核型反映了细胞中染色体数量和结构的特征。根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置,将人的外周血淋巴细 5

胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G 7组共23种类型。每组染色统体形态

大小不同,X染色体归入C组,Y染色体归入G组。本实验的人外周血淋巴细胞

采于他人(男性)。根据各组染色体的特征予以分组:

A组:包括三对染色体,即1、2、3号。它是最大的一组染色体,在长度上 三者略有差别。l号最大,中央着丝粒。长、短臂差别不大。长臂有时可见一狭

窄的次缢痕;位置大约在离着丝粒1/3处,由于次缢痕的存在,往往导致长臂的

长度发生变异。2号较1号小,为亚中央着丝粒染色体,长臂和短臂易区分开。3

号是第二大的中央着丝粒染色体。是A组中最小的l个。这个染色体大约比第1

号染色体短1/3~1/4 。

B组:包括二对染色体,即4和5号。这是二对最大的而又特别明确的亚中

央着丝粒染色体。这两对染色体的短臂相对较短,故易于与A组、C组相临

号序的染色体相互区分。在非显带标本上,4号、5号不易区分。

C组:包括七对常染色体,即6~12号,X性染色体也列入此组。中等大

小,具亚中着丝粒染色体。该组染色体数目多,它们的大小相差不大,在常

规标本中是最难将它们一一识别的。一般说,6、7、8、11号和X染色体的着

丝粒略靠近中央,短臂相对较长,而9、10、12号染色体的着丝粒偏离中央,

既短臂相对较短。第9号染色体的长臂上常有一较大而明显的次缢痕,从着丝

点处延伸到长臂的中部。有时第11号染色体的长臂也会发现有次缢痕,位置

在长臂的1/4~l/3处,第12号是C组中最小的一对,但不易与组内其它4

对较短的相互区别。X染色体的大小在第7、8号之间。

D组:包括三对染色体,即13、14、15号,是一组大的近端着丝点染色

体。常规标本不易将三对染色体加以区分,本组染色体的短臂上均具有随体,

但不一定同时显现。随体的大小存在着个体差异。外周血培养时,在叶酸和

血清含量低的培养液中,随体的显现率有所提高。

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E组:包括三对染色体,即16、17、18号染色体。在较好的标本中。这三对染色体很易相互区分。

第16号为中央着丝粒染色体,在长臂的近着丝粒处有一次缢痕,它的存在使这对染色体的长度有较大的变异。17号为中等大小的亚中央着丝粒染色体,其短臂能看得清楚。18号为亚中央着丝粒染色体,是E组中最小的一对染色体,其短臂很小;较易与17号相区别。

F组:包括二对染色体,即19、20号,是最小的一组中央着丝粒染色体,这二对染色体之间不易区分。

G组:包括二对常染色体,即21、22号,和1个Y染色体,是最小的一组近端着丝粒染色体,第21、22号有随体,但在同一细胞中不一定同时显现。第21、22号染色体长度略有差别,但为适应临床上已将先天愚型沿用为21三体(显带证明与此综合征相关的是较小的第22号染色体) 综合征的习惯叫法,根据巴黎会议(1971)的建议,把最小的一对改称为21号,稍大的一对称第22号,并排在21号的后面。Y染色体无随体,比21、22号染色体长些,通常着色较深,长臂端部模糊不清,长臂常较合拢,不那么分叉,着丝粒不明显。

七、实验结论

人的一个典型的中期细胞染色体都已纵裂成2条染色单体,称姐妹染色单体,由一个着丝粒相连。每条染色体以着丝粒为界可分为长、短两个臂。根据着丝粒位置的不同,可将人类的染色体分为中部着丝粒染色体、亚中部着丝粒染色体、近端着丝粒染色体和端部着丝粒染色体四类。根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置,将人的外周血淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G 7组共23种类型。每组染色统体形态大小不同,X染色体归入C组,Y染色体归入G组。

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参考文献

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