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浙液相色谱讲义四:梯度方法的开发及梯度分离时的注意事项

发布时间:2013-11-12 09:37:02  

液相色谱的方法开发
(二)梯度方法

梯度洗脱的特点
? 优点

?单位时间的分离能力增加 ?检测灵敏度提高
? 缺点

?仪器设备要求高 ?不适合某些检测方式 ?柱需再生 ?定量分析的重复性较低

梯度的洗脱方式
? 高压梯度及低压梯度

A



溶 剂 比 例 A 混 合

混 合 器 ( 溶 剂 混 溶 剂 泵 泵 B 溶 剂 B

A

B 低 高 压 梯

梯度洗脱的可变参数
? A及B液的成分和化学特性 ? 梯度的陡度 ? 梯度的变化形状

1 35 2 4 6

1 79 1 80 1

如不用梯度:分离不理想

梯度条件的优化

梯度曲线的变化∶凹线

梯度曲线的变化∶凸线

梯度平衡时间的影响(一)

10分钟的梯度,6分钟的平衡时间色谱图不重复

梯度平衡时间的影响(二)
平衡时间∶6分钟 平衡时间∶7分钟 平衡时间∶8分钟 平衡时间∶9分钟

平衡时间从6到7分钟,第一个峰的保留时间有明显的 变化,说明6到7分钟的平衡时间不足,而8到9分钟变化 不大因而大于这个时间时,平衡充足。

有机污染物的影响(一)

50ml超纯水的有机物污染状态

有机污染物的影响(二)

“三蒸水”有大量的有机污染物不适合梯度分析

有机污染物的影响(三)

典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高 灵敏度梯度分析

梯度方法开发实例 - 第一步
开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法,用C18 柱,在最初的条件下(0-100% 水-乙腈),分离不理想。 整个色谱峰组保留时间太长,分离度也不好。

梯度方法开发实例 - 第二步
为使色谱峰前移,提高起始时乙腈的比例(50100%,水-乙腈),分离得到改善。但是9个化合物出了 10个色谱峰,说明有杂质存在,很可能是流动相水中的。

梯度方法开发实例 - 第三步

从空白梯度图显示,在同样 的色谱条件,同样的检测灵敏度 下,共有两个杂质峰。说明流动 相水中的杂质在此条件下可能会 对检测有影响。

梯度方法开发实例 - 第四步
空白梯度图同样品的色谱图进行对照后,我们看到杂质(共两个峰)中的第一个小峰 对第8个色谱峰有干扰,会使其定量分析结果不准确。

梯度方法开发实例 - 第五步
根据“梯度曲线下的面积越大,洗脱能力越强”的规律,试用#5 曲线使3-9号峰提前(曲线5,50-100%B),但是小峰仍没有分出来。

梯度方法开发实例 - 第六步
根据“梯度曲线下的面积越大,洗脱能力越强”的规律,试用#5 曲线使3-9号峰提前,改用50-95%B见到好的现象。

梯度方法开发实例 - 第七步
最后用50-90%B,曲线4,得到好的结果。


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