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浙液相色谱讲义二:液相色谱的方法开发-分离机理及色谱柱

发布时间:2013-11-12 09:37:07  

液相色谱的方法开发
分离机理及色谱柱

选HPLC参数时的基本考虑
? 溶解度

- 选择流动相的条件 ? 分子量 - 在样品预处理或GPC分析时有用 ? 官能团 - 有否离子化基团? 保留特性如何 ? ? 样品的基质 - 考虑如何前处理 ? 在基质中样品的含量 - 分析、制备都考虑 ? 检测特性 - 有否紫外吸收? 荧光? ? 找出样品中不同组份之间的差异
?摸索条件的重要线索

极性问题

液相色谱的分离机理
? ? ? ? ?

正相 反相 体积排除 离子交换 其他

?不同的分离模式是不同的机理

吸附色谱的分离机理
? 随着样品在固定 相上的吸附能力 由大到小 ? 在色谱柱上的保 留由长到短

吸附色谱概述
? 分离基于样品的极性差异。 ? 洗脱次序∶一般为正相,即:极性低的先

被洗脱 ? 常用的流动相∶
?非极性有机溶剂,如己烷 ?乙酸等为添加剂
? 常用固定相∶

?硅胶、氧化铝、羟基磷灰石等。

分配色谱的分离机理

分配色谱概述
反相色谱的主要类型,基于分子的极性分离 ? 洗脱次序:一般为反相,即极性高的先被洗脱 ? 常用的流动相:
?

?有机溶剂如甲醇、乙腈,水 ?应用添加剂,成为离子对、离子抑制方法
?

常用固定相:
?碳十八、碳八、胺基等基团 ?反相色谱固定相多为键合相?

键合相色谱柱
以硅胶为基质,通过化学键合方式把碳十八、碳 八、胺基等基团联在基质上,作为固定相。 ? 优点∶
?

?固定相稳定,不易流失 ?应用广泛,可使用多种溶剂 ?消除硅羟基的不良影响
?

缺点∶
?pH值不能小于3 ?同样填料,各种牌号色谱柱不尽相同

体积排除色谱的分离机理

凝胶色谱概述
? ? ? ? ?

?

凝胶渗透(GPC)、凝胶过滤(GFC) 分离基于分子在溶液中的体积大小 洗脱次序:大分子先被洗脱 流动相不参与分离,只起溶剂作用 分离效率低 色谱行为容易预测

GPC的校正
分子量大于 V0 或小于Vt 的分 子不能分离

离子交换树脂的分离机理

离子交换色谱概述
? 适用于离子型化合物的分离 ? 分离基于离子的带电特性 ? 洗脱次序受多种因素的影响

?填料(离子交换树脂)的种类∶阴/阳,强/ 弱,交换基团 ?? ? ? ?? S S? ?P P C C? ? ? t ?样品分子特性 ? ? ?盐的种类、浓度 S P ?温度及pH值 S ? 样 品 ?有机溶剂 P ? 填 料

离子交换树脂的交换容量

液相色谱柱及分离机理的关系
?

从色谱方法上分
?正相 / 反相 ?离子交换 ?分子体积排除 ?亲合 ?疏水回受

?

从柱子类型上分
?分配 / 吸附 ?离子交换 ?凝胶 ?亲合

色谱柱化学及外形结构的关系
液 柱 相 色 谱 填 料

柱 管

颗 粒 表 颗 长 径

面 粒 度 性 度 质 内 料 材 化, 学 性 质 ∶ k 分 辨 率

?

机 械 因 素 ∶

N

寿 速 耗 命 度 , , 柱 溶 效 剂 , 消

对HPLC柱的了解
? 平均颗粒度,颗粒度分布

?颗粒度(dp)
? 颗粒度越小:柱效越高(传质好,涡流扩散小)

柱压越高(渗透性差)

?颗粒分布
? 颗粒分布越宽∶柱效低(渗透性差)

?颗粒形状
? 球型∶柱效高、重现性好、柱床结构均匀 ? 无定型:柱床结构不均匀

流动相线性速度不均匀 谱带扩展

对HPLC柱的了解(二)
平均孔径/孔体积 ? 孔径/孔体积分布
?

?大的孔径可分析高分 子量的分子

对HPLC柱的了解(三)
? 键合相化学

?影响化合物的分离度:? ?不同键合相对不同种类的化合物分离不同 ?可能导致色谱的分离机理不同 ?如:C18、C8、CN

对HPLC柱的了解(四)
? 含碳量
? 含碳量越高,k‘值越大(固定相传质效应增加



?高含碳量
? 有利于不易保留的化合物的分离 ? 水解稳定性好,重现性好 ? 有利于极性化合物的拖尾改善

?低含碳量
? 有利于分析中性及碱性化合物 ? 降低溶剂损耗

不同色谱柱的含碳量
色谱柱
的乙腈/水) Symmetry C18 Zorbax ODS LiChrosorb RP-18 Symmetry C8 Resolve C-18 Ultrasphere ODS Partisil ODS-3 mBondpak C-18 Nova-Pak C-18 19 17 15 12 12 11 11 10 7 7.9 5.5 11.3 12.0

C%
17 15.7 10.3 12.5

k‘苊

(50/50

12.4

对HPLC柱的了解(五)
? 填料的端基封口

?封口残余硅羟基 ?减少不可逆吸附或拖尾 ?增加碳含量(0.1% - 1%)

残基处理的效果
① 抗坏血酸 ② 烟酰胺 ③ 对氨基苯甲酸 ④ 哌咯西叮 ⑤ 核黄素 ⑥ 苯酚 ⑦ 盐酸硫胺

NovaPak C18

未封口 C18

对HPLC柱的了解(六)
? 硅胶的活性

?主要影响碱性化合物的保留行为:k' ?生产硅胶时处理温度不同,硅胶活性也不同 ?是选择性差异的主要来源
? 硅胶的杂质含量

?重金属含量低,硅羟基活性小,拖尾减小 ?是色谱柱质量好坏的重要标志

对HPLC柱的了解(七)
? 填料的稳定性

?硅胶填料 ?pH:2-8
? 聚合物填料

硅解 胶曲 的线 溶

?pH:2-12 ?pH值小于2时 键合相水解
1 3 5 7 9 2 4 6 8 p H

Waters各种硅胶基质的色谱柱
C1 C4 C6 C8 C18 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Phenyl ? CN ? ? ? ? NH2 ?

m BandaPak
Resolve Nova-Pak Delta-Pak Symmetry Spherisorb

Waters不同品牌的色谱柱
? mBondaPak

?文献背景强, 是工业标准 ?平均孔径125A,10m高活性、无定形硅胶 ?中等疏水性表面,端基封口。有独特选择性
? Nova-Pak

?平均孔径60A,4m高韧度低活性球形硅胶 ?低酸性,高疏水性,好的端基封口 ?有利于小分子物质的分析

Waters不同品牌的色谱柱
? Resolve

?平均孔径90A,5/10m低

活性硅胶 ?非常高的疏水性,无端基封口 ?有利于低保留的中性及酸性化合物分离
? Delta-Pak

?有100A和300A两种孔径,5/15m硅胶 ?中到高的疏水性,端基封口 ?适合于多肽、蛋白的分离及制备色谱

新一代硅胶基质的色谱柱
?

Symmetry
?高纯度硅胶:Fe,Al,Mg等均<10ppm ?孔径100A,5m球形颗粒,端基封口 ?超高含碳量:C18/19%,C8/12% ?表面积:300 m2/g ?孔体积:1mL/g ?特点
? 好峰形,好重现性,不同的选择性,使用寿命长

Waters聚合物基质的反相柱
? 特殊设计的多孔聚合物胶 ? 有很宽的

pH 适应范围(2-12)

?可用离子抑制方法分析碱性化合物
? 有非常不同的选择性
? 柱效及韧性比相应的硅胶柱低

? 色谱机理不太清楚
? 文献背景低,用户少

色谱柱的规格
? 内径

?检测的灵敏度 ?样品的容量
? 长度

?分离度,理论塔板数 ?速度 ?样品的容量 ?检测的灵敏度


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