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浙液相色谱讲义三:分离方法,离子抑制及离子对方法介绍

发布时间:2013-11-12 09:37:08  

液相色谱的方法开发
(一)分离方法

第一步干什么?
? 想办法得到各种信息

?向同行了解是否做过此类样品,或有否类似 样品的分析方法 ?查文献,如CA(化学文摘) ?仪器制造商的文献,如Waters
? 对色谱柱有足够的了解

?掌握分离机理,自己开发方法
? 充分了解您自己的样品

分析时要了解哪方面的情况?
? 灵敏度的要求有多高? ? 样品的本底是否很复杂? ? 有多少组份要分析? ? 对分析的精确度、准确度等有多高要求? ? 是否因是日常检验,而要求方法容易使用?

分离时要了解哪方面的情况?
? 要分离(即制备)的样品量有多大? ? 要分离的组份在样品中的含量很高?

还是

微量? ? 是否需要保持生物活性? ? 对分离产物纯度的要求有多高? ? 纯度或活性的鉴定如何完成?

一般的具体步骤
? 先用一根短的色谱柱 ? 用相对较高的流速 ? 使用尽可能纯度高的标准品 ? 先用高强度的洗脱液 ? 调节k’

请 记 住 ∶ 值改变保留值 每 次 改 变 一 个 参 数

? 调节a值改变选择性
? 调节柱长度改变柱效及分离速度

使用文献方法
? 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? ? 注意文献方法的流动相

?是否损害色谱柱? ?如色谱填料品牌不同,需要调整流动相
? 注意色谱柱的规格:内径、柱长

?需要调整流速、进样量
? 注意梯度条件 ? 了解系统的滞后体积(梯度)

色谱方法转换
? 如果没有与文献或要求相近的色谱柱

?转换进样量
( D现在 ) 2 L现在 进样量( Load) ? Load初始 ? ( D初始 ) 2 L初始 D ? 内径,L ? 长度

?转换流速
( D现在 ) 2 流速( F ) ? F初始 ? ( D初始 ) 2 D ? 内径

反相色谱的方法开发
? 开发过程实例

?色谱条件∶
? 色谱柱:C18,4mm×30mm

? 流动相:乙腈/水,不同的溶剂强度,60/40、

50/50、40/60,由强渐弱 ? 流速:2ml/min

?样品:
① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)

改变容量因子 K'
① ① ① 谱图 5 0 / 5 0 ② ③ 6 0 / 4 0 4 0 / 6 0

② ② ③③

改变选择性∶a
? 通过改变流动相改变选择性

?同样强度的不同溶剂

①THF / H 2O, : 72 28 ②MeOH / H 2O, : 42 58 ③CH 3CN / H 2O, : 62 38

? 改变色谱柱

离子型化合物的分离方式
? 使用离子交换柱∶离子交换法

?主要用于“强”阴、阳离子
? 使用反相柱

?离子抑制色谱法
? 通过改变流动相的pH值,使样品成中性

?离子对色谱法
? 加入“对离子”,使样品呈中性

离子抑制色谱
? 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 ? 改变流动相的pH值,抑制样品离子的电离 ? 适用于弱酸性化合物的分离

?降低

流动相的pH值,使样品降低离子化 ?使用硅胶基质C18填料
? 使用条件应在填料基质的范围内

?硅胶柱的pH在2-8(较保险值3-7)内

常用缓冲液及其pH值

离子抑制色谱实例
?

在乙腈/水及pH=7时, 多数保留时间很短,无 法完全分离。

CHO

COONa

CHO

COOH

OCH3 OH 1 2 3 OCH3 4

离子抑制色谱的使用范围
如果: 一些酸在pH低于2时还保持离子化 一些碱在pH高于7时还保持离子化 ? 可以有以下的选择
?离子交换色谱 ?使用聚合物反相柱,在pH高于7时用离子抑 制法 ?使用“离子对色谱法”

在高pH值下用离子抑制
色谱柱:D18-613(聚合物基质),室温 流动相:乙腈/0.01M NH4OH + 0.01M TBA 流 速:1.0ml/min 检 测:UV-240nm 样 品:巴比妥的衍生物 ① 巴比妥 ② 己琐巴比妥 ③ 甲基苯巴比妥 ④ 速可巴比妥

离子对色谱法
? 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂

?与样品中可电离的组份形成“对离子” ?在反相色谱柱上分离离子型化合物
? 离子对试剂的类型

?PIC A:磷酸季丁铵,适用于弱酸 ?PIC B:烷基磺酸盐,适用于弱碱
? 烷基长度不同,形成对离子的能力不同 ? 通常有:B5,B6,B7,B8

?PIC D4:磷酸二丁胺,适用于弱碱

离子对色谱机理

用离子对?还是离子抑制?

离子对色谱的应用

抗组胺及减充血剂药物的分析

使用五烷基磺酸盐
Packing: Column: Solvent: ?Bondapak C18 4 mm ID x 30cm Methanol/H2O with 0.005M PENTANE

Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50
Flow Rate: 2.0 ml/min Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS

1. Maleic Acid 2. Phenylephrine

3. Phenylpropanolamine
4. Naphazoline 5. Phenacetin

6. Pyrilamine

使用六烷基磺酸盐
Packing: Column: Solvent: ?Bondapak C18 4 mm ID x 30cm Methanol/Water with 0.005M HEXANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50) 1. Maleic Acid

2. Phenylephrine-HCl
3. Phenylpropanolamine-HCl 4. Naphazoline-HCl 5. Phenacetin 6. Pyrilamine Maleate

Flow Rate: 2.0 ml/min
Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS

使用七烷基磺酸盐
Packing:
Column: Solvent:

?Bondapak C18
4 mm ID x 30cm Methanol/Water with 0.005M HEPTANE Sulfonic Acid & 1% HOAc (50/50)

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Maleic Acid Phenylephrine Phenylpropanolamine Naphazoline Phenacetin Pyrilamine

Flow Rate: 2.0 ml/min
Detector: UV, 254 nm, 0.1 AUFS

样品浓度对分析的影响

0U .A 0 2

0 .U 2 A

P7度 0M样 大 I的 , , 度 C 浓为在较 B 很0 低1 . 0 品时 浓, 如 ③ P足 右 号 C而 图峰 ,由 第于 分 I 不。 叉

离子对色谱分析水溶性维生素
N

1 c ie .i ia Nm a d n 烟 酰 胺 C O N H
2

C H O H 2 HH O C HH O C HH O C C H 2 NNO

HN C 3

{
3

2io 3 .yx P ie r n d N 哆 H 素3 , C N H O C H O 吡 H 2 O C H O H V B 6 2 3o .i f i Ra bn lv + NS H NH C 核 黄 素 , CO HH C H C l N N V B 2 C H C H
H C
2 22 2 3

V 1 4 m 素 . i ie , T n胺 h a 硫B

用不同的离子对试剂
④ ②


色B P 1 谱n k ∶a 8 o d ? ② 柱a C 3× . 3 9 0 m 0 m m m 溶e 2 C 剂H , B ∶H I 1 /P7 . M OO 2H,B ./P5 MHI e2C OO3H,B ./P7 MHI/ e2CB OO-5

① ① ④ ③③ ③ ④ ①
1 P 7 2 P 53 P 7 . I ,用 如 用 C B . I, I 如 C - . C B 如 用 B 在 的① ② 情② 加 份 ③ 分 峰 不, 开 ④ B 组 分 5 各 况 时 下 间 , 保 开 留 分 留 开 , 且 保 太 长 时 间 合 适

离子对色谱 - 水溶性维生素
保 P 剂关 留I B 的 时试 间 与 之 C 间 系

3 6 m l

1 B V () 胺 硫
) B V ( 素 黄 核2

保留体积ml
4 m l

B V () 素 哆 吡6
B 55 5 0/ %) (B B 7

胺 酰 烟
B 7

方法开发的其他因素
? 流速对柱效的影响

?不同内径的色谱柱有自己的最佳流速
? 样品的进样量(浓度)对柱效的影响

? 样品的进样体积对柱效的影响
? 溶剂粘度对柱效的影响

以上因素均影响分离度

结论
? 充分用已知样品结构确定以哪种方法开始

?普通反相? 离子抑制? 离子对? 还是其他
? 观察流动相条件改变时色谱峰的移动

?根据变化的方向及大小决定下一步干什么
? 改变参数时要合理,每次只改动其中一个

变量! ? 色谱柱的改变影响最大


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