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现代分子生物学复习资料小强版

现代分子生物学复习资料小强版


UMBRELLACORP
——Our business is life itself
现代分子生物学
第一章 绪论

编辑 Hunter2-1 0885#
一、三大发现:列文·虎克的细胞学说、焦耳用实验确立的能量守恒定律、达尔文的进化论。 二、 分子生物学定义: 从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学 , 主要指遗传信息的传递 (复 制) 、保持(损伤和修复) 、基因的表达(转录和翻译)与调控。 三、分子生物学研究内容:1、DNA 重组技术(基因工程) 分子生物学) 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究 2、基因的表达调控 3、生物大分子的结构和功能研究(结构

四、DNA 发现的几个实验:美国科学家 AVERY 用 S 型和 R 型致病菌侵染小鼠的实验、美国科学家 HERSHEY 在 1952 年从 事的同位素分子标记法噬菌体侵染细菌的试验。

第二章
一、染色体的结构和组成

染色体与 DNA
真核生物染色体有蛋白

原核生物:DNA 形成一系列的环状附着在非组蛋白上形成类核。

质和 DNA 组成,蛋白质包括组蛋白(H1,H2A、H2B、H3、H4)和非组蛋白。 2、C 值是一种生物的单倍体基因组 DNA 的总量。 C 值往往与种系的进化的复杂程度不一致,某些低等生物却有较大的 C 值,这就是著名的“C 值反常现象”。 3、DNA 的一级结构:指 4 种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序, DNA 序列是这一概念的简称。 4、双螺旋的基本特点:双链反向平行配对而成;脱氧核糖和磷酸交替连接,构成 DNA 骨架,碱基排在内侧;内侧碱基通 过氢键互补形成碱基对(A:T,C:G) 。 5、DNA 的二级结构指两条多核苷酸链反向平行盘绕所产生的双螺旋结构。是有 Watson 和 Crick 在 1953 年共同发现的。分 类:右手螺旋(是其通常存在形式) :A-DNA,B-DNA。左手螺旋:Z-DNA。 6、超螺旋:DNA 双螺旋结构中,一般每转一圈有十个核苷酸对,双螺旋总处于能量最低状态。正常 DNA 双螺旋额外的多 转或少转几圈,就会出现双螺旋空间结构改变,在 DNA 分子中形成额外张力,若此时 DNA 分子的末端是固定的或是环状 分子,双联不能自由转动,额外的张力就不能释放而导致 DNA 分子内部院子空间位置的重排,造成扭曲,即出现 超螺旋 结构。 从 DNA 到染色体过程的压缩过程: ①核小体的形成是染色体中 DNA 压缩的第一个阶段, 在核小体中 DNA 盘绕组蛋白八聚 体核心,从而使分子收缩至原尺寸的 1/7。 ②染色质细丝盘绕成螺旋管状的粗丝,每个螺旋管包含 6 个核小体,其压缩比为 6。 ③螺旋管进一步压缩形成超螺旋,压缩比是 40. 6×40×5。 7、DNA 的半保留复制:由亲代 DNA 生成子代 DNA 时,每个新形成的子代 DNA 中,一条链来自亲代 DNA,而另一条链 则是新合成的,这种复制方式称半保留复制。 8 半不连续复制:DNA 复制过程中,前导链的合成以 5’——3’方向,随着亲本双链体的解开而连续进行复制;后随链在合 成过程中,一段亲本 DNA 单链首先暴露出来,然后以与复制叉移动相反的方向,按照 5’——3’方向合成一系列的冈崎片 段,然后再把它们连接成完整的后随链。这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制在生物界是有普遍性的,因而称为双 ④超螺旋圆筒进一步压缩 5 倍便成为染色体单体。 总压缩比是 7×

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螺旋的半不连续复制。 9、从复制原点到终点,组成一个复制单位,叫复制子。复制时,解链酶等先将 DNA 的一段双链解开,形成复制点,这个 复制点的形状象一个叉子,故称为复制叉。 10、线性 DNA 双链的复制方式:⑴、将线性复制子转变为环状或多聚分子。⑵、在 DNA 末端相处发夹式结构。⑶、在某种 蛋白质的介入下,在真正的末端上启动复制。 环状双链 DNA 的复制分为θ型、滚环型和 D-环型几种类型。

11、后随链的复制由引发体来引发,引发体像火车头一样在后随链分叉的方向上前进,并在模板上断断续续的引发生成后随 链的引物 RNA 短链,再由 DNA 聚合酶 III 作用合成 DNA,直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由 RNaseH 降解 RNA 引 物并由 DNA 聚合酶 I 将缺口补齐,再由 DNA 连接酶将两个冈崎片段连在一起形成大分子 DNA。 12、冈崎片段:DNA 复制过程中,两条新生链都只能从 5'端向 3'端延伸,前导链连续合成,滞后链分段合成。这 些分段合成的新生 DNA 片段称冈崎片段。 13、DNA 的修复包括错配修复(恢复错配) 、碱基切除修复(切除突变的碱基) 、核甘酸切除修复(修复被破坏的 DNA) 、DNA 直接修复(修复嘧啶二体或甲基化 DNA) 、SOS 系统(DNA 的修复,导致变异) 14、 DNA 的转座或叫移位 (transposition): 由可移位因子(transposable element) 介导的遗传物质重排现象。 座子(transposon Tn) :存在于染色体 DNA 上可自主复制和位移的基本单位。 2、复合转座子 3、TnA 家族 ② 原核生物转座子的类型:1、插入序列 转

15、DNA 的复制酶:①引物合成酶(此酶以 DNA 为模板合成一段 RNA,这段 RNA 作为合成 DNA 的引物)

DNA 聚合酶{原核生物中的 DNA 聚合酶(聚合酶Ⅰ主要是对 DNA 损伤的修复;以及在 DNA 复制时切除 RNA 引 物并填补其留下的空隙。聚合酶Ⅱ修复紫外光引起的 DNA 损伤。聚合酶Ⅲ是 DNA 复制的主要聚合酶,还具有 3’ -5’外切酶的校对功能,提高 DNA 复制的保真性。(真核生物中的 DNA 聚合酶:聚合酶ɑ:引物合成。聚合酶β: ) 损伤修复。聚合酶γ:线粒体 DNA 的复制。 聚合酶δ:核 DNA 的复制。 聚合酶ε:与后随链合成有关) DNA 连接酶:DNA 连接酶在 DNA 复制、损伤修复、重组等过程中起重要作用 ③ ④DNA 拓扑异构酶:拓扑异构酶?:

使 DNA 一条链发生断裂和再连接,作用是松解负超螺旋。主要集中在活性转录区,同转录有关。拓扑异构酶Π: 该酶能暂时性地切断和重新连接双链 DNA,作用是将负超螺旋引入 DNA 分子。同复制有关。DNA 解螺旋酶 /解链 酶:通过水解 ATP 获得能量来解开双链 DNA。

第三章
编辑 : 纪明昌
RNA 复制
中心法则: 中心法则

复制

DNA

转录 逆转录

RNA

翻译

蛋白质

转录:是指拷贝出一条与 DNA 链序列完全相同(除了 T→U 之外)的 RNA 单链的过程,是基因表达的核心步骤。包括: 转录 模板识别,转录起始,转录延伸,转录终止。 转录单元(transcription unit)一段从启动子开始至终止子结束的 DNA 序列。 有意义链和反义链:我们把与 mRNA 序列相同的那条 DNA 链成为编码链 coding strand 或称有意义链 sense strand,并把另 有意义链和反义链 一条根据碱基互补原则指导 mRNA 合成的 DNA 链成为模板链 template strand 或称反义链 antisense strand。 聚合酶:全酶 全酶: 核心酶:α2ββ′ 原核 RNA 聚合酶 全酶 α2ββ′σ 核心酶 聚合酶:根据 根据它们对α-鹅膏蕈碱(α真核 RNA 聚合酶 根据 酶 RNA 聚合酶Ⅰ RNA 聚合酶Ⅱ RNA 聚合酶Ⅲ 位置 核仁 核质 核质 转录产物 rRNA hnRNA tRNA α2ββ′σ(全酶 holoenzyme)=α2ββ′+σ amanitin)的敏感性不同分为 RNA 聚合酶 I、II、III。 RNA 聚合酶 I 对 相对活性 50-70% 20-40% 约 10% 对α-鹅膏蕈碱的敏感性 不敏感 敏感 存在物种特异性

α-鹅膏蕈碱不敏感 ,RNA 聚合酶 II 对低浓度α-鹅膏蕈碱敏感 ,RNA 聚合酶 III 对高浓度α-鹅膏蕈碱敏感

RNA 聚合酶全酶与启动子区闭合双链 DNA 结合形成二元闭合复合物 二元闭合复合物(全酶、模板 DNA) 二元闭合复合物

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再解链为二元开链复合物,转录起始,形成三元复合物 二元开链复合物, 三元复合物(全酶、模板 DNA、新生 RNA) 因子释放,RNA 合成开始 ,σ 二元开链复合物 三元复合物 启动子定义:指能被 RNA 聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段 DNA 序列。 启动子定义 原核生物启动子结构 -10 signal (TATA box,Pribnow box) 酶的紧密结合位点(富含 AT 碱基,利于双链打开) -35 signal( TTGACA )提供了 RNA 聚合酶全酶识别的信号 transcription start site –10 区和 区和-35 区的最佳距离 -10 区与-35 区的最佳间距大约是 16~19bp. Pribnow 区下降突变(TATAAT→AATAAT) Pribnow 区上升突变(TATGTT→TATATT) 真核生物启动子结构 1、核心启动子 核心启动子(core promoter)指保证 RNA 聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的 DNA 序列,包括转录起始位点及转 核心启动子 录起始位点上游 TATA 区 -25bp~-30bp TATA box DNA 解链开始转录位置 2、上游启动子元件(upstream promoter element,UPE ) (1)CAAT box (2)更上游 3、增强子 顺式作用元件(cis-acting element)定义:影响自身基因表达活性的非编码 DNA 序列。 能直接、间接辨认和结合转录上游区段 DNA 的蛋白质,现已发现数百种,统称为反式作用因子 反式作用因子(trans-acting factors)。 反式作用因子 反式作用因子中,直接或间接结合 RNA 聚合酶的,则称为转录因子 转录因子(transcriptional factors, TF)。 转录因子 原核与真核生物 mRNA 的特征比较 原核生物 mRNA 的特征: 原核 mRNA 的半衰期短,细菌内 mRNA 的转录、翻译与降解几乎是同时进行 许多原核 mRNA 以多顺反子的形式存在 原核 mRNA 的 5’端无帽子结构或只有短的 Poly(A)尾巴 在起始密码子 AUG 上游 7-12 个核苷酸处, 有一段可与核糖体 16S rRNA 配对结合的、 富含嘌呤的 3-9 个核苷酸的共同序列, 一般为 AGGA,此序列称 SD 序列 使得结合于 30S 亚基上的起始 tRNA 能正确地定位于 mRNA 的起始密码子 AUG 序列. 真核生物 mRNA 的特征 真核 mRNA 的 5’端存在帽子结构 端存在帽子结构 有利于核糖体对 mRNA 的识别,Cap0 必需帽子结构具有增强翻译效率的作用:增加 mRNA 的稳定性,避免核酸酶的作用 绝大多数真核 mRNA 具有 Poly(A)尾巴 ( ) mRNA 穿越核膜的能力有关,影响到 mRNA 的稳定性和翻译效率。polyA+与 polyA终止分为两类: 终止 ●强终止子-内部终止子:不依赖 Rho (ρ)因子的终止。 ●弱终止子 -需要ρ因子(rho factor) ,又称为ρ依赖性终止子( Rho-dependent terminator 不依赖于ρ 不依赖于ρ因子的终止 模板 DNA 上存在终止转录的特殊信号终止子又称为内在终止子,内在终止子 1、终止位点上游一般 存在一个富含 GC 碱基的二重对称区,由这段 DNA 转录产生的 RNA 容易形成发卡结构 2、在终止位点签名有一段 4· 个 ·8 A 组成的序列,所以转录产物的 3’端为寡聚 U 这种结构的存在决定了转录的终止 依赖于ρ 依赖于ρ因子的终止 ρ 因子结合于新合成的 RNA 链,借助水解 ATP 的能量沿 RNA 链运动,当 RNA 聚合酶遇终止子停止 时, ρ 因子追上酶,促使转录终止。 转录后加工 5’端加帽 3’端加尾 RNA 的剪接 RNA 的编辑 端加帽 端加尾 5’端加帽 端加帽 -75 左右,RNA 聚合酶结合有关 转录因子结合其上

GC box

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5’端的一个核苷酸总是 7-甲基鸟核苷三磷酸(m7Gppp) 。mRNA5’端的这种结构称为帽子(cap) 。 ①能被核糖体小亚基识别,促使 mRNA 和核糖体的结合; ②m7Gppp 结构能有效地封闭 mRNA 5’末端,以保护 mRNA 免 受 5’核酸外切酶的降解,增强 mRNA 的稳定。 3’端加尾 提高了 mRNA 在细胞质中的稳定性 端加尾 RNA 的剪接(Splicing)生物体内内含子的主要类型:P98 将转录形成的 mRNA 前体(pre-mRNA)中的内含子剪除,将外显子连接起来的加工过程. 参与 RNA 剪接的物质:snRNA(核内小分子 RNA)snRNP(与 snRNA 结合的核蛋白) RNA 的编辑 是指转录后的 RNA 在编码区发生碱基的突变、加入或丢失等现象。 内含子(intron) :真核细胞基因 DNA 中的不编码序列,这部分序列并不编码蛋白质,又称间隔序列。 内含子 外显子(exon or extron) 外显子 :真核细胞基因 DNA 中的编码序列,这部分序列可转录为 RNA,并翻译成蛋白质,也称表达序列。 . 可译框架( 可译框架(ORF,open reading frame) , ) 真核生物断裂(不连续)基因在表达过程中时必须经历的步骤. mRNA 前体内含子的剪接 hnRNA:(heterogenous nuclear RNA) mRNA 原始转录产物或前体 100-300 核苷酸,以 U 分类:U1-6

snRNA:(small nuclear RNA)

snRNP:(small nuclear ribonucleoprotein) 核酶(ribozyme)指一类具有催化功能的 RNA 分子,通过催化靶位点 RNA 链中的磷酸二酯键的断裂,特异性的剪切底物 核酶 RNA 分子,从而阻断基因的表达。

生物信息的传递( 第四章 生物信息的传递 ( 下 ) 从 mRNA 到蛋白质
王应卓 编辑 : 王应 卓
遗传密码 (genetic code): (二)遗传密码的性质(特点) 1.密码的连续性:读码无标点、无重叠,阅读方向为 5’→3’ 2.密码的简并性 ? ? ? ? ? 大多数氨基酸都存在几个密码,由一种以上密码子编码同一个氨基酸的现象称为密码子的简并性(degeneracy) 。 密码子碱基数确定和对应性(64 个密码子对 20 种氨基酸) 确定同一个氨基酸的不同密码称为同义密码(synonymous codons) 。 密码的简并性可以减少碱基突变造成的有害效应。 在标准遗传密码表中,只有一个密码子的氨基酸是 Trp 和 Met。 指阅读 mRNA 模板上的三联体密码时,只能沿 5’→3’方向进行。 DNA(或 mRNA)中核苷酸序列与蛋白质中氨基酸序列之间的对应关系。

3.密码的方向性

4.密码的摆动性 1966 年,Crick 提出摆动假说(Wobble hypothesis) ? ? ? ? ? tRNA 上的反密码子与 mRNA 上的密码子配对时,密码子的第一位、第二位碱基配对是严格的,第三位碱基可以有 一定变动,这种现象称为密码的摆动性或变偶性(wobble) 。 I(肌苷,次黄嘌呤核苷)→A、U、C 配对。 遗传密码无论在体内还是体外,无论是对病毒、细菌、动物还是植物而言都通用。 在真核细胞线粒体中, UGA 不是终止密码子,是 Trp 的密码子;

5.密码的普遍性与特殊性

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? ? 第二节

AUA 不是 Ile 的密码子,而是 Met 的密码子; AGA 和 AGG 不是 Arg 密码子,而是终止密码子。 tRNA

tRNA:运送特定氨基酸到核糖体上合成蛋白质。 一、tRNA 的二级结构 ? ? ? 二级结构:三叶草型 三级结构:倒 L 型 稀有核苷含量多

tRNA 的功能 在蛋白质合成中,起着运载氨基酸的作用,按照 mRNA 链上的密码子所决定的氨基酸顺序将氨基酸转运到核糖体的特定部 位。 ? ? ? ? 3’端 CCA-OH 上的氨基酸接受臂 识别氨酰 tRNA 合成酶的位点 核糖体识别位点 反密码子位点

(一)起始 tRNA 和延伸 tRNA 一类特异地识别 mRNA 模板上起始密码子的 tRNA 叫起始 tRNA,其他 tRNA 为延伸 tRNA. ? ? 原核起始 tRNA 携带 fMet 真核起始 tRNA 携带 Met

氨基酰-tRNA 的表示方法:真核生物: Met-tRNAiMet;原核生物: fMet-tRNAifMet。

1、无义突变 在蛋白质的结构基因中,一个核苷酸的改变可能使代表某个氨基酸的密码子变成终止密码子(UAG、UGA、UAA),使 蛋白质合成提前终止,合成无功能的或无意义的多肽,这种突变就称为无义突变. 2、错义突变 错义突变是由于结构基因中某个核苷酸的变化使一种氨基酸的密码变成另外一种氨基酸的密码. 3、 原核生物翻译过程中核糖体结构模式: 位: P 肽酰位(peptidyl site)、A 位: 氨基酰位(aminoacyl site)、 位: E 排出位(exit site)

(一)原核生物翻译起始复合物形成 1) 1、 翻译起始需要的几种成分: 30S 小亚基、 模板 mRNA、fMet-tRNAfMet、 三个翻译起始因子(IF-1、 IF-2 、 IF-3) 、 GTP、50S 大亚基、Mg 2+

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四 、肽链合成的终止和释放 I. II. III. IV. 识别: (释放因子)识别终止密码, 识别:RF(释放因子)识别终止密码,进入核糖体的 A 位 水解: 使转肽酶变为酯酶, 之间的酯键被水解, 水解:RF 使转肽酶变为酯酶,多肽链与 tRNA 之间的酯键被水解,多肽链释放 脱离:模板 mRNA、RF 以及空载 tRNA 与核糖体脱离 脱离: 、 分子伴侣( 分子伴侣(molecular chaperone) )

2、 能够在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质。是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质。 、 能够在细胞内辅助新生肽链正确折叠的蛋白质。是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白质。 按是否自发性折叠分为:热休克蛋白和伴侣素。 按是否自发性折叠分为:热休克蛋白和伴侣素。 4、信号肽假说:信号肽假说内容: (1)蛋白质合成起始首先合成信号肽 )蛋白质合成起始首先合成信号肽 (2)SRP(信号识别蛋白)与信号肽结合,翻译暂停 ) (信号识别蛋白)与信号肽结合, 受体结合,核糖体与膜结合, (3)SRP 与 SRP 受体结合,核糖体与膜结合,翻译重新开始 ) (4)信号肽进入膜结构 ) (5)蛋白质过膜,信号肽被切除,翻译继续进行 )蛋白质过膜,信号肽被切除, (6)蛋白质完全过膜,核糖体解离 )蛋白质完全过膜, ●信号肽: 常指新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移的 N-末端氨基酸序列(有时不一定在 N 端) 。 3、蛋白质转运机制: 蛋白性质 运转机制 主要类型

蛋白质在结合核糖体上合成,并以翻译- 免疫球蛋白、卵蛋白、水解酶、激素等 分泌 运转同步机制运输

蛋白质在游离核糖体上合成,以翻译后 核、叶绿体、线粒体、乙醛酸循环体、过氧 细胞器发育 运转机制运输 化物酶体等细胞器中的蛋白质

膜的形成

两种机制兼有

质膜、内质网、类囊体中的蛋白质

5、蛋白质降解中泛素的参与:蛋白质的降解依赖于泛素(ubiquitin,Ub) 。 泛素由76个高度保守的氨基酸组成,普遍存在于真核生物中,故名泛素。它最初是从小牛的胰脏中分离出来的。 共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶体识别和降解,这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍途径。26S 蛋白酶 体是一个大型的蛋白酶,可将泛素化的蛋白质分解成短肽。 泛素相当于蛋白质被摧毁的标签,被贴上标签的蛋白质就会被运送到细胞内的“垃圾处理厂”,在那里被降解。 降解涉及到的三种重要酶:E1,E2,E3 的作用: 降解涉及到的三种重要酶 E1 激活泛素分子, E2 就负责把泛素分子绑在被降解蛋白质上。 E3 能识别被降解的蛋白质。 7、核糖体循环步骤:核糖体循环包括多肽链合成的进位、转肽、脱落和移位三步反应。 核糖体循环包括多肽链合成的进位、转肽、脱落和移位三步反应。 核糖体循环包括多肽链合成的进位

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第五章分子生物学的研究方法( 第五章分子生物学的研究方法(上)
编辑: 编辑:闫国栋
1.基因操作 基因操作:主要包括 DNA 分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因的人工 基因操作 合成、定点突变和 PCR 扩增等。 基因工程:指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入新的宿主细胞 基因工程 内并获得持续稳定增值能力和表达。 基因工程技术实际上是核酸操作技术的一部分。 技术-基因工程流程 重组 DNA 技术 基因工程流程 1.分—载体和目的基因的分离 分 2.切—限制性内切酶的应用 切 3.接—载体与目的基因连接成重组体 接 4.转—基因序列转入细胞 转 5.筛—目的基因序列克隆的筛选和鉴定 筛 6.表-目的基因在宿主细胞的表达 表 限制性内切酶切割方式有两种 1) 错位切割,产生互补性的粘性末端。 ) 错位切割,产生互补性的粘性末端。 、错位切割 、 错位切割所产生的 DNA 末端,两条链不平齐,一条链凸出,一条链凹进,这种末端称为黏性末端。带有相同黏性末 端的 DNA 分子很容易在末端互补配对,连接成新的重组分子。 2) 沿对称轴切割,产生平齐末端 ) 沿对称轴切割, 、 基因库,也叫基因组文库, DNA 文库( DNA library) 基因库,也叫基因组文库, 文库( 是指用克隆的方法将一种生物的全部基因组长期以重组体方式保持在适当的宿主中。 将生物细胞基因组 DNA 通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组 DNA 片段随机地同相应的载体重组、克隆,所 产生的克隆群体代表了基因组 DNA 的所有序列。这样保存的基因组是多拷贝、多片段,当需要某一片段时,可以在这样的 “图书馆”中查找(没有目录) 。 cDNA 文库 首先获得 mRNA,反转录得 cDNA,经克隆后形成文库。 cDAN 文库和基因组文库的不同之处在于,cDNA 文库除却了 mRNA 拼接过程中除去的内含子等成分,便于 DNA 重组的使 用。其复杂性比基因文库低得多。 主要用于研究蛋白质的氨基酸顺序,可根据克隆的 cDNA 分子的核酸序列直接推倒出来。 分子杂交:是通过各种方法将核酸分子固定在固相支持物上,然后用标记的探针与被固定的分子杂交,经显影后显示出目的分 分子杂交 子所处的位置的过程. 分子杂交包括: DNA-DNA 杂交 (原位杂交、 点杂交、 Southern 杂交)DNA-RNA 杂交 , (Northern 杂交) 及蛋白杂交 (Western 杂交)等。 Southern 杂交用途 杂交用途: 用来检查 DNA 样品中是否存在有某个特定的基因,而且还可知道其大小及酶切位点的分布。 Northern RNA 印迹杂交用途 印迹杂交用途:用来检查基因组中某个特定的基因是否得到转录 。 聚合酶链式反应(PCR) 体外酶促合成特异 DNA 片段的新方法,主要由高温变性、低温退火和适温延伸 高温变性、 高温变性 低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成 . SNP 单核苷酸多态性 single nucleotide polymorphism 指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的 DNA 序列多态性. 只涉及到单个碱基的变异(转换或颠换),也可由碱基的插入或缺失所致。 环形双链质粒 DNA 分子具有三种不同构型: 分子具有三种不同构型: 共价闭合环状的 SC 构型 DNA(cccDNA) ,开环的 OC 构型 DNA(ocDNA) , 线性的 L 构型 DNA (LDNA) , 三者具有不同的电泳迁移率,可在琼脂糖凝胶电泳中分开。共价闭环>线状>开环 蓝白斑筛选出阳性菌落: 蓝白斑筛选出阳性菌落 Lac Z’ 半乳糖苷酶基因,在含 Xgal 培养基上呈蓝色,插入外源 DNA,重组子培养呈白色

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pUC 质粒,可插入外源基因片段长度约 10kb。将外源基因插入到 MCS 中,随质粒的表达而表达,增殖而扩增。外源基因插 入到 MCS 后,β-半乳糖苷酶的活性丧失而不显兰色菌落。如果不插入外源基因,则产生兰色。从而筛选阳性菌落。

第七章
编辑:动药女生 编辑:动药女生
基因表达的方式 ? ? 组成性基因表达 适应性表达(诱导和阻遏表达)

1、组成性基因表达 某些基因在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达,通常被称为管家基因 (house-keeping gene)。 无论表达水平高低,管家基因较少受环境因素影响,而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达,或变化 很小。区别于其他基因,这类基因表达被视为组成性表达。 2、调节蛋白 操纵子(operon)包括俩个区 控制区:1)调节基因(Regulatory gene)——为阻抑蛋白编码基因 2)启动基因(Promoter)——为 cAMP 受体蛋白(CRP)和 RNA 聚合酶结合区。 3) 操纵基因(0perater)——为阻抑蛋白结合位点。 信息区——由一个或数个结构基因串联在一起组成。 由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位,其中结构基因转录受操纵基因所控制。 ? 操纵基因是顺式控制元件,阻抑蛋白是反式作用因子 序列。通常是非编码序列。包括启动子、增强子及沉默子等。 真核生物的顺式作用元件 是指可影响自身基因表达活性的特异 DNA 2、调节蛋白 是调节基因转录的蛋白因子,如原核生物的阻遏蛋白和 CAP 蛋白(降解物基因活化蛋白) 、真核生物的基本转录因子和特异 转录因子等。 原核基因调控机制的类型与特点 (一) 原核基因调控机制的类型

1、负调控 negative regulation 在没有调节蛋白质存在时基因是表达的,加入某种调节蛋白质后基因活性就被关闭,这样的控制系统就叫做负控系统 。 ? ? ? ? ? 其调节蛋白质叫做阻遏蛋白 两种类型:负控诱导和负控阻遏 在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的, 加入某种调节蛋白质后基因活性就被开启, 这样的控制系统就叫做正控系 统。 其调节蛋白质叫做无辅基诱导蛋白(激活蛋白) 两种类型:正控诱导和正控阻遏系统

2、正调控 positive regulation

(二)特殊代谢物调节基因表达的类型 1、可诱导调节 一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下, 由原来关闭的状态转变为工作状态, 即在某些物质的诱导下使基因活 化. 调节分解代谢的操纵子,同时受 cAMP-CAP 的活性调节 2、可阻遏调节 一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下,由原来开启的状态转变为关闭状态,基因的表达被阻遏. 调节合成代谢的操纵子

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(三)原核生物基因表达调控的特点 调节的主要环节在转录水平上进行 σ因子决定 RNA 聚合酶识别特异性 主要通过操纵子模式进行调节 阻遏蛋白对转录的抑制作用(阻遏机制)是普遍存在的负调控作用 原核生物中基因的组织形式 几个作用相关的基因在染色体上串连排列在一起,由同一个调控系统来控制。 这样的一个整体称为一个操纵元(operon)。 大肠杆菌至少有 6 种σ因子 σ70:负责识别一般的启动子 σ54:识别与氮代谢有关的基因启动子 σ32:识别热激(heat shock)蛋白质基因启动子 。 2、细菌的应急反应的机制:应急信号: 鸟苷四磷酸(ppGpp) 鸟苷五磷酸(pppGpp) 、 诱导物:空载 tRNA 乳糖操纵子与负控诱导系统:乳糖操纵子(lac operon)的结构与组成 酶的诱导-lac 体系受调控的证据 1、实验证据 在不含乳糖及β-半乳糖苷的培养基中,lac+基因型每个大肠杆菌细胞内大约只有 1~2 个酶分子。 如果在培养基中加入乳糖,酶的浓度很快达到细胞总蛋白量的 6%或 7%,每个细胞中可有超过 105 个酶分子 2、实验用诱导物 ? ? ? ? 乳糖 IPTG(异丙基巯基半乳糖苷) TMG(巯甲基半乳糖苷) ONPG(O-硝基半乳糖苷)

乳糖操纵子模型 1、Z、Y、A 基因的产物为一条多顺反子 mRNA

lacZ:编码β-半乳糖苷酶,它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖; lacY:编码半乳糖苷透性酶,它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁; lacA:编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶,进行乳糖代谢。 2、P 区位于 I 与 O 之间,O 为阻遏物结合位点:阻遏物与 O 区的结合影响了 RNA 聚合酶与启动子区结合形成转录起始复 合物的效率。 4、 CAP 的正性调节:ATP 在腺苷酸环化酶的作用下转变成环式 Catabolite activating protein, CAP 代谢激活蛋白,是 cAmp 的受体蛋白 (cyclic Amp receptor protein, CRP) cAmp-CAP 复合物,是 lac 操纵元的正调控因子 无葡萄糖时 camp 浓度高,反之则低。 5、 协调调节 ? ? ? ? ? 当阻遏蛋白封闭转录时,CAP 对该系统不能发挥作用; 如无 CAP 存在,即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合,操纵子 仍无转录活性。 单纯乳糖存在时,细菌利用乳糖作碳源; 若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时,细菌首先利用葡萄糖

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lac 操纵子的本底水平表达 因为诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合,而运转诱导物需要透过酶。 在非诱导状态下有少量(1-5 个 mRNA 分子)lac mRNA 合成--本底水平组成型合成。 3、阻遏物 lacI 基因产物及功能 4、葡萄糖对 lac 操纵子的影响 ? ? ? 葡萄糖 腺苷酸环化酶活性降低 ATP 无法转变成 cAMP 不能形成 CAP-cAMP 复合蛋白 RNA 酶无法结合在 DNA 上 结构基因不表达。 代谢物阻遏效应 研究认为葡萄糖的某些降解产物抑制 lac mRNA 的合成,这种效应称之为代谢物阻遏效应.

5、cAMP 与代谢物激活蛋白 cAMP-CRP 复合物与启动子区的结合 lac mRNA 合成起始所必需的,有利于形成稳定的开放型启动子-RNA 聚合酶结构。 lac 基因产物数量上的比较 ? ? ? Z、Y、A 三个基因产物的拷贝数比例为 1:0.5:0.2 1、Lac mRNA 可能在翻译过程中的核糖体相脱离,从而终止蛋白质链的翻译。 2、Lac mRNA 分子内部,A 基因比 Z 基因更易受内切酶作用发生降解,故 Z 基因的完整拷贝数要比 A 基因多。 原因:在翻译水平上的调节

(三)操纵子的融合与基因工程 操纵子的融合:由较弱启动子和强启动子的基因形成的融合基因,可以通过强启动子使弱启动子的转录增强,增加蛋白表达 量。 四.色氨酸操纵子与负控阻遏系统 特殊代谢物调节基因活性的类型 可诱导调节:调节分解代谢的操纵子,同时受 cAMP-CAP 的活性调节 可阻遏调节:调节合成代谢的操纵子 阻遏型操纵子:辅阻遏蛋白无活性,不能与操纵基因结合,结构基因表达. 色氨酸操纵子主要参与调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。 当细胞内缺乏色氨酸时, 此操纵子开 放,而当细胞内合成的色氨酸过多时,此操纵子被关闭。 色氨酸操纵子的调控机制与乳糖操纵子类似,但通常情况下,操纵子处于开放状态,其辅阻遏蛋白不能与操纵基因 结合而阻遏转录。 而当色氨酸合成过多时, 色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白, 后者与操纵基因结合而使基因转 录关闭。 弱化子与前导肽 ? ? 在操纵区与结构基因之间的一段可以终止转录作用的核苷酸序列,当操纵子被阻遏时,RNA 合成被终止, 这段核苷酸起终止转录信号作用. 起调节作用的是某种氨酰-tRNA 的浓度

三)mRNA 前导区的序列分析 前导区 mRNA 上有两个连续的色氨酸密码子;前导序列上有 4 个分别以 1、2、3、4 表示的片断能以两种不同的方式进行碱 基配对,有时以 1-2 和 3-4 配对,有时只以 2-3 方式互补配对. 提高效率。 二、稀有密码子对翻译的影响 实验证据 RNA 引物由 dnaG 基因编码的引物酶催化合成 dnaG、rpoD 及 rpsU 属于大肠杆菌基因组上的同一个操纵子 基因转录出来的三个蛋白相应的 mRNA 拷贝数大体相同,由于翻译的调控使得蛋白的拷贝数发生了很大的变化。

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由于细胞内对应于稀有密码子的 tRNA 较少,高频率使用这些密码子的基因翻译过程容易受阻,影响了蛋白质合成 的总量。 三、重叠基因对翻译的影响 重叠基因对翻译的影响 重叠的密码保证了同一核糖体对两个连续基因进行翻译的机制。 偶联翻译是保证两个基因产物在数量上相等的重要手段。 六、魔斑核苷酸水平对翻译的影响 空载氨酰-tRNA 对蛋白质和 RNA 的合成速度进行调控 (一)严紧控制和松散控制 1、严紧控制(基因型 rel+) ? ? 当细菌处于饥饿条件下,缺乏维持蛋白质合成的氨基酸,其大部分活性区域将被关闭,此称之为严紧控制。 严紧控制导致两种特殊的核苷酸积累:PPGpp、pppGpp 松弛突变株(基因型 rel- )去除了严禁控制反应; 蛋白质合成停止,但 RNA 的合成速度没有下降; 氨基酸的匮乏不会导致(p)ppGpp 的合成; 若有严紧因子存在,也能合成(p)ppGpp. (二)调控机制 应急信号: 鸟苷四磷酸(ppGpp) 、 鸟苷五磷酸(pppGpp) 诱导物:空载 tRNA 真核生物基因表达( 第七章 真核生物基因表达(下) 真核基因组的结构特点 1、在真核细胞中,一条成熟的 mRNA 链只能翻译出一条多肽链,不存在原核生物中常见的多基因操纵子。形式 2、真核细胞 DNA 都与组蛋白和大量非组蛋白相结合,只有一小部分 DNA 是裸露的。 3、高等真核细胞 DNA 中很大部分是不转录的,大部分真核细胞的基因中间还存在不被翻译的内含子。 4、真核生物能有序地根据生长发育阶段的需要进行 DNA 片段重排,还能在需要时增加细胞内某些基因的拷贝数。 一、基因家族 定义:真核基因组中来源相同,结构相似,功能相关的一组基因.可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。 基因家族的种类 :简单的多基因家族、复杂多基因家族、发育调控的复杂多基因家族 简单的多基因家族:以串联方式前后相连 rRNA 复杂的多基因家族:一般由几个相关基因家族构成,基因家族之间由间隔序列隔开,并作为独立的转录单位.。组蛋白基因 家族 四、DNA 甲基化与基因活性的调控 (一) DNA 的甲基化 DNA 甲基化能关闭某些基因的活性,去甲基化则诱导了基因的重新活化与表达。 DNA 的甲基化能提高该位点的突变频率,因而可作为诱变剂或致癌因子调节基因表达。 1、甲基化的类型:5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤 Xist 甲基化,不转录 去甲基化,转录 X 染色体 活性 失活 其他位点 去甲基化,活性 甲基化,失活

2、松弛控制(基因型 rel-)

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(二) DNA 的甲基化机制基因转录的机理 甲基化达到一定程度时会发生从常规的 B-DNA 向 Z-DNA 的过渡。又由于 Z-DNA 结构收缩,螺旋加深,使许多蛋 白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。 DNA 甲基化导致某些区域 DNA 构象变化,影响蛋白质与 DNA 的相互作用;抑制转录因子与启动区 DNA 的结合 效率。 (三) DNA 的甲基化与 X 染色体 雌性胎生哺乳动物细胞中两条 X 染色体之一在发育早期随机失活 X 染色体失活中心(X-chromosome inactivation center,Xic): 定位在 Xq13 区(正好是 Barr 氏小体浓缩部位) Xist 基因(Xi-specific transcript):只在失活的 X 染色体上表达. 真核生物转录水平的调控:RNA 聚合酶、顺式作用元件、反式作用因子、转录起始的调控 一、顺式作用元件 顺式作用元件:能与特异性转录因子结合,以决定转录的起始位点、转录效率及转录的时空特异性的 DNA 序列称顺式作用 元件 (一)启动子 ? ? promoter:真核基因启动子由核心启动子和上游启动子元件(UPE)两个部分组成. 在基因转录起始位点(+1)及其 5‘上游大约 100~200bp 以内的一组具有独立功能的 DNA 序列. 决定 RNA 聚合酶Ⅱ转录起始点和转录频率的关键元件.

核心启动子(core promoter):保证 RNA 聚合酶Ⅱ转录正常起始所必需的、最少的 DNA 序列。包括转录起始位点及转录起始 位点上游-25~-30bp 处的 TATA 盒。核心启动子单独起作用时,只能确定转录起始位点并产生基础水平的转录上游启动子元 件(upstream promoter element,UPE):包括通常位于-7Obp 附近的 CAAT 盒(CCAAT)和 GC 盒(GGGCGG)等;能通过形成转 录前复合物调节转录起始的频率,提高转录效率。 真核基因启动子的多元性:并不是每个基因的启动子区都包含这三个 UPE 真核基因启动子的 UPE 对转录起始的决定性作用可能是各个 UPE 之间的距离,而不是序列本身.。 1、 启动子:核心启动子(core promoter)、上游启动子元件(upstream promoter element,UPE)2、增强子 、 3、转录因子:TFIID(TBP(TATA-binding protein) 、TAFIIs(TBP-associated factors)、TFIIA、TFIIB 、TFIIF 、TFIIE ) 三、反式作用因子 (一)) 反式作用因子/转录调节因子的概念及特点 凡能与 RNA 聚合酶或顺式作用元件相互作用并影响基因表达的调节蛋白。 真核细胞调节蛋白可分为正调控因子和负调控因子 三个功能结构域:DNA 识别结合域(BD) ;转录激活域(AD);结合其他蛋白的结合域 1、 DNA 结合结构域:螺旋-转折-螺旋结构 HLH;同源域蛋白 homodomain, HD HTH;锌指结构 zinc finger;碱性-亮氨酸拉链 bZIP;碱性-螺旋-环-螺旋

2、 转录激活结构域:酸性α-螺旋结构域(acidic α–helix domain)、富含谷氨酰胺结构域(glutamine-rich domain)、富含脯氨 酸结构域(proline-rich domain) 五、 真核生物转录水平调控的特点:真核基因转录调节是复杂的、多样;不同的 DNA 元件组合可产生多种类型的转录调节 方式;多种转录因子又可结合相同或不同的 DNA 元件;转录因子与 DNA 元件结合后,对转录激活过程所产生的效果 各异,有正性调节或负性调节之分;真核生物的调控多以正性调控为主。

补充: 乳糖操纵子(lac) :1、包括三个结构基因:Z、Y、A 以及启动子,控制子和阻遏子。转录时 RNA 聚合酶首先与启动区结 合,通过操纵区向右转录,转录从 O 区中间开始,按 Z-Y-A 方向进行,每次转录出来的一条 mRNA 上都带有这三个基因, 转录的调控实在启动区和操纵区进行的。 2、Z、Y、A 基因的产物为一条多顺反子 mRNA。lacZ:编码β-半乳糖苷酶,它可以将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖;lacY: 编码半乳糖苷透性酶,它能将乳糖运送透过细菌的细胞壁;lacA:编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶,进行乳糖代谢。3、调控 方式:负调控:诱导物:实际上是异构乳糖。正调控:葡萄糖腺苷酸环化酶活性降低, ATP 无法转变成 cAMP 不能形成

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CAP-cAMP 复合蛋, RNA 酶无法结合在 DNA 上结构基因不表达。

真核细胞与原核细胞在基因转录翻译和 DNA 空间结构方面存在如下几个方面的差异: 在真核细胞中,一条成熟的 mRNA 链只能翻译出一条多肽链,类似原核生物中常见的基因操纵子形式不多。2、真核细胞 DNA 都与组蛋白和大量非组蛋白相结合,只有一小部分 DNA 是裸露的。3、高等真核细胞 DNA 中很大部分是不转录的, 一些有几个或几十个碱基组成的 DNA 序列,在整个基因组中重复几百万次甚至上万次,此外,大部分真核细胞的基因中间 还存在不被翻译的内含子。4、真核生物能有序地根据生长发育阶段的需要进行 DNA 片段重排,还能在需要时增加细胞内 某些基因的拷贝数。这种能力在原核生物中也是极为罕见的。5、在原核生物中转录的调节区都很小,大部分位于转录起始 位点上游不远处,调控蛋白结合到调节位点上可直接促进或抑制 RNA 聚合酶对它的结合,在真核生物中,基因转录的调节 区则大得多,它们可能远离核心启动子达几百个甚至上千个碱基对,虽然这些调节区也能与蛋白质相结合,但是并不直接影 响启动子区对于 RNA 聚合酶的接受程度, 而是通过改变整个所控制基因 5’上游区 DNA 构型来影响它与 RNA 聚合酶的结合 能力。6、真核生物的 RNA 在细胞核中合成,只有经转运穿过核膜到达细胞质后,才能被翻译成蛋白质,原核生物不存在 这样严格的空间间隔。7、许多真核生物的基因只有经过复杂的成熟和剪接过程,才能被顺利的翻译成蛋白质。

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