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第九章酵母菌遗传

第九章酵母菌遗传


第九章 酵母菌遗传
酵母菌属于真核微生物,其细胞内除了具有与原核生物不同 的由核膜包围的核以外,还像其他真核细胞一样,含有如下 成分:内质网、高尔基体、线粒体、液泡和过氧化物体,它 是最简单的真核生物。

酵母菌同时又具有原核生物的某些特征,如它们可以像细菌 一样在平板上迅速生长形成单菌落,也可像细菌一样进行分 裂,重要的是酿酒酵母(Saccharomyces cerevtsiae)的 基因组只是大肠杆菌的2.6倍,因此酿酒酵母已成为目前在 分子水平上研究真核生物的重要材料。

第一节 酵母菌的基因组和染色体
一、酵母菌的基因组
1996年:完成酿酒酵母全基因组的测序,是当时完成测序 的最大基因组,也是真核生物中第一个被测序的生物。 1、酿酒酵母的单倍体细胞含有16条染色体,总长度为 12068kb,其中第Ⅰ条染色体最短(230kb ),第Ⅳ条染色 体最长(1532kb) 。 2、基因组中没有明显的操纵子结构,有间隔区和内含子。 3、酿酒酵母染色体基因组中,有5885个可能是编码蛋白 质的ORF,每个ORF约为1.4kb,而基因间的平均间隔为 600bp。

4、ORF大约占整个基因组70%,其中一半是已知的基因或 与已知基因有关的基因,其余是新基因。 5、酿酒酵母中约4%编码蛋白质的基因含有内含子,而在粟 酒裂殖酵母(Schizosaccha-romyces pombe)中,40%编 码蛋白质的基因具有内含子。 除此之外,约140个基因编码核糖体RNA(rRNA),275个基 因编码tRNA。编码 rRNA的140个基因以串联形式全部排列 在第Ⅶ染色体上;275个tRNA基因(属于43个家族)分散于所 有染色体中。基因组含有52个完整的Ty因子(反转座子)。

二、酵母菌的染色体结构

同其它真核细胞一样,酵母菌的DNA也是与4 种主要的组蛋白结合形成核小体结构,并进一步形 成染色质。但不同的是,在酿酒酵母中没有H1组 蛋白,该蛋白在高等生物的有丝分裂过程中使染色 质维持高度超螺旋的致密结构方面起着关键作用。

真核生物染色体的生物 学功能都严格依赖于三 种DNA序列结构:着丝 粒、端粒和复制起点, 它们是染色体功能实现 的三个基本要素。下面 就从这三方面介绍酵母 菌的染色体结构特征。

1.着丝粒(centromere) 着丝粒是真核细胞染色体DNA上的一段特殊序列。在有 丝分裂和减数分裂时,纺锤丝 (着丝粒结合蛋白)与着丝粒 结合,将染色体拉向细胞的两极 。

着丝粒有两种主要类型:
第一种:短着丝粒 (约200bp),又叫点着丝粒(point centromere),酿酒酵母的着丝粒就属于这种类型。 第二种:区域着丝粒(regional centromere),其着丝粒序 列较长(从 40kb到几个Mb),含有很多重复序列, 真菌(如脉孢菌)、果蝇、哺乳动物和人的着丝粒都 具有这种结构特征。 所有真核生物的着丝粒功能都相同,但其DNA却具有种的 特异性。

在酿酒酵母中,所有染色体的着丝粒序列(centromeric sequence,CEN)的长度均大约为130bp,由5′→3′依次分 为 CDEⅠ、CDEⅡ和CDEⅢ三个区。CDEⅠ和CDEⅢ是两个 共有序列,位于两侧,中间是CDEⅡ由 78~86个核苷酸组成, CDEⅡ的核苷酸序列中A+T含量超过90% 。

CEN序列抗核酸酶消化的能力比其它染色质区域大,可 能结合着一个经修饰的核小体或有一个蛋白质复合体来保 护着CEN序列。

CDEII处的DNA形成一个环,包裹着一组蛋白:Cse4p与CBF3结 合CDE-III、CBF1结合CDE-I,这些蛋白被Ctf19、Mcm21、 Okp1连接并接合到微管上

2.端粒(telomere)

端粒是真核生物线性染色体两端的特殊DNA-蛋白质复合体 结构,这种复合体结构是由 DNA重复序列和与之相结合的蛋 白质分子构成的。
在大多数生物中,端粒DNA只是由几个碱基组成的DNA重 复单位通过串联重复而形成,长度从20bp到几个kb不等。

酿酒酵母端粒DNA的长度约为300bp,其DNA重复单位为 5′C1-3A 3′G1-3T

几种生物端粒的重复单位 生物 物种
Tetrahymena,Paramecium
Stylonchia Oxytricha,Euplotes Trypanosoma,Leishmania Saccharomyces Arabidopsis Phyparum,Dictyostelium Homo Sapiens

DNA来源

重复单位(5'-3')

四膜虫
尖毛虫 鞭毛虫

大核
大核
微染色体

CCCCAA
CCCCAAAA CCCTA

酵母
拟南芥菜 泥毛霉菌

染色体
染色体 rDNA 染色体

C2-3A(CA)1-3
C3TA3 CCCTA C3TA2



端粒结构特征:
1)每一个端粒都含有一系列的短的正向重复顺序。这些 顺序都可用Cn(A/T)m这一通式来表示,其中n>1, 而m=1~4。 2)在端粒区域中有一种特殊的不连续排列,产生单链断 裂的形式,即存在游离的3 ’- 端羟基。 这种结构并不能被连接酶将缺口封闭起来。这表明 这种断裂所形成的缺口较大。 提纯的天然的端粒区可直接用E.Coli DNA多聚酶I 进行缺口平移(nick translation),表明 在端粒区确有缺口存在,缺口中的3'-OH为缺口平移 时新链的合成提供了引物。

3)富含G的端粒DNA链以5’至3’延伸到染色体末端时,超出 与之互补的富含C链的12-16个核苷酸,形成一条富含G的单链, 回折形成自身G-G配对,因此它们不被核酸酶所识别,增加其 稳定性。 1987年E.Henderson等用非变性聚丙稀酰胺凝胶电泳, 吸热变性分析以及核磁共振光谱分析了端粒的顶端结构,证实 了端粒顶端回折形成发夹结构,这一结构并不是由通常的 Watson-crick配对,而是通过G-G配对而形成,富含G的特点 对形成特殊的G-G配对及染色体的复制有着重要意义。 4)端粒的双链部分中含有T2G4的顺序在3'末端,排列方向是 朝向染色体的中心部位。

5)在细胞中,端粒总是和一些非组蛋白相结合,形成复合 体,常表现为异染色质或构成染色体的末端结节。所以,在 对染色体处理后进行硝酸银染色时,发现端粒部位出现浓染, 其它部位出现浅染或不染色。 D.E.Gottschling和K.A.Zakian(1986年)在尖毛虫 (Dxytricha)中发现两种端粒蛋白,分子量分别为55Kd, 26Kd。它们与端粒DNA紧密结合,能抗高盐提取和核酸酶 的处理。他们推测这种DNA与蛋白的结合是非共价结合,可 能是依赖氢键和范德华力的作用。人们进一步发现在体外这 种端粒蛋白与端粒的重复顺序也能形成复合体。

端粒

染色体DNA

端粒

重复的CCCCAA链

3‘ 5‘

重复的GGGGTT链

5’-CCCCAAOHCCCCAACCCCAACCCCAAOHCCCCAA-----3’

3’-GGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTT-------5’

端粒末端回折结构

环是由端粒的3’ 单链末端取代双 链DNA中的同源 区形成的,这个 过程由TRF2催 化。

端粒结合蛋白(TRF)
端粒帽
5’

染色体DNA

端粒帽
3’

n(CCCCAA)
n(GGGGTT)

(TTGGGG)n
(AACCCC)n

保护端粒不受核酸酶或化学修饰的作用 一般是紧密的非共价键结合 具有序列特异性

端粒的功能
(1)端粒给染色体末端提供了一个保护性的“帽 子”,防止染色体的融和、丢失和降解,并参与染 色体和核基质的结合。 (2)解决“末端复制问题” 。 端粒的存在以其长 度的缩短来阻止遗传信息的丢失,从而维持了基因 组的完整性. (3)影响染色体的行为 (4)可能控制细胞的寿命 (5)和核骨架的组成有关



3.复制起点 酵母的复制起点是指染色体上控制DNA复制起始的一小 段DNA序列,通常称为自主复制序列(autonomously replicatory sequence,ARS)。 自1979年首次发现酿酒酵母的ARS以来,已在酿酒酵母 中发现约有400个ARS, 平均40kb染色体DNA上有一个 ARS。但这些ARS的使用频率不同,变动在0-100%之间。 粟酒裂殖酵母基因组中, ARS/20-50kb染色体DNA 。

(1)自主复制序列ARS的结构: 酿酒酵母中,ARS是长度为100-200bp、富含AT的 DNA片段。根据其在质粒中稳定性的实验结果,可将ARS分 为A、B、C三个结构域,其中A和B最为重要。 A:由11bp核苷酸(A/T)TTTAT(A/G)TTT(A/T)组成 的保守序列,即 (ARS consensus sequence,ACS) , ACS是自主复制序列的必需因子,其单一碱基的突变能降低 或消除起始功能。 B:位于ACS的3′末端,长度约80bp,含B1,B2,B3三个 功能区。只要A 域存在,任意两个B元件都可以使原点具有 功能。 C:结构域位于ACS的5′末端,这一结构域也富含AT,但 C结构域之间不具有同源性,也不含共有序列。

(2) ARS-结合蛋白 ?ORC:由6种分子质量分别为120kD、72kD、62kD、 57kD、53kD和50kD的蛋白质以复合物的形式组成,这种蛋 白质复合体叫做起始识别复合物(origin recognition complex,ORC)。相当于Dna A和 λ的O蛋白,与 A/B1 结合。 ?Cdc6:相当于DnaC,及λ的P蛋白,使Mcm蛋白结合到复合 体上。此对在Origin上起始复制是必须的。

?Mcm:相当于DnaB,螺旋酶。
?ABF1( ARS-binding factor 1,转录因子):结合于B3。

ABF1

酵母的复制区和复制起点

(3) ARS启动染色体复制的活性: 酿酒酵母基因组中约有 400个ARS,但并不是所有的ARS在原染色体上都具有自主 复制活性。 对第Ⅲ染色体(62%)上的ARS进行了系统分析,ARS编 号从300到314: 其中ARS305、306、307、309和310在大多数细胞循 环中都具有复制起始活性; ARS308仅在10%~20%的细胞循环中能起始复制; 其余的ARS则在染色体上无起始复制活性。

从使用的时序来看,大体可分为两类:

一类是在S期的前期启动邻近序列的复制,另一类则在S后 期使用。另外,靠近端粒的ARS一般不具有活性。
将这些染色体上的 ARS克隆到质粒上后,却都具有自主复 制的特性。为何ARS在质粒中具有活性,而在原染色体上却 无活性?这一问题还有待于进一步探讨。

第二节 酵母菌中的质粒
一、2μm质粒 酵母中的2μm质粒是一个环状、周长2μm的6kb双链DNA 分子。2μm质粒存在于大多数酿酒酵母菌株中,位于酵母细 胞核内,拷贝数为50~100。

该质粒只携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因(REP1、 REP2、REP3和FLP),不赋予宿主细胞任何遗传表型,属于 隐蔽质粒。

显著特征是质粒 上有两个600bp 长的反向重复序 列(IR),两个IR 相距2.7kb。

在两个IR上各有 一个FRT (专一 性重组位点), 由于这两个FRT 间的相互重组, 产生两种互变异 构型的混合质粒, 即A型和B型。

REP3
FRT

REP1 REP2
FRT

REP2

A-type
FRT

B-type
FRT

REP1

FLP

FLP

REP3

二、嗜杀现象

1963年,Bevan和Makower发现酿酒酵母中的某些菌株可 以产生毒素而杀死其他酵母,这种现象被称为嗜杀现象。 将产生毒素的酵母菌株称为嗜杀株(killer) 对毒素敏感的菌株称为敏感株 既不产毒素又不对毒素敏感的菌株称为中性株 嗜杀株对毒素有免疫性,敏感株不产生毒素。

?酵母嗜杀现象:是由两种具有自我复制能力的细胞遗传因 子——双链线状 RNA(dsRNA)决定的,通常以蛋白质外壳 包裹着的粒子状态存在于细胞质中。 ?不具有体外侵染的特性,与病毒粒子不同,故称之为嗜杀 质粒。 ?具有蛋白外壳,因此又被称为类病毒颗粒(virus-like particle)。

根据dsRNA存在状态,将其分为L-型和M-型: ?L型类病毒:含有4.5kb的双链RNA,称为L-dsRNA,有 两个ORF,编码L型和M型类病毒的蛋白外壳和复制病毒 RNA的RNA聚合酶。因此, M型和L型类病毒的蛋白外壳相 同,都是由L-dsRNA编码。 ?M型类病毒:含有两个相同的1.8kb双链RNA,称为MdsRNA,编码毒素蛋白,从细胞中分泌出去。 ?这两种细胞质遗传因子不具有细胞外感染能力,但它们可 以通过酵母的高频率接合而在酵母中广泛传播。

?在大多数嗜杀酵母菌中,dsRNA只占酵母核苷酸总量的 0.1%,其中L-dsRNA占 dsRNA总量的90%。几乎所有 酵母菌都有L型类病毒。 ?酵母只有L型类病毒而无M型类病毒,不具备嗜杀性,是 嗜杀敏感型酵母;只有同时具备L型类病毒和M型类病毒, 酵母才具有嗜杀性。 ?故有人称M型类病毒为嗜杀质粒,称L型类病毒为辅助颗 粒。不同的嗜杀酵母菌株中有不同的M型类病毒,从而编码 合成和分泌不同的毒素蛋白,表现出不同的嗜杀表型。

嗜杀型酵母

敏感型酵母

含L型类病毒 和M型类病毒

只含L型类病毒 不含M型类病毒


L型类病毒: 含有4.5kb的 双链RNA M型类病毒:含 有两条1.8kb双 链RNA

不含L型类病毒 不含M型类病毒

第三节 接合型基因及其基因型转换
一、酿酒酵母的生活史
酿酒酵母具有单倍体和二倍体细 胞,从自然界中分离的菌株一般 都是二倍体细胞。在适宜的条件 下,二倍体细胞能产生子囊孢子。 通常每个产囊细胞形成一个子囊, 内含4个子囊孢子,其中2个属于 一种接合型,另2个属于一种接 合型,分别以“a”和“α”表示。 每一个子囊孢子发芽后长成一个 单倍体细胞,这种细胞只能出芽 繁殖,不能产生子囊孢子。属于 不同接合型的子囊孢子或单倍体 细胞才能接合形成a/α杂合二倍 体细胞,经减数分裂,又产生4 个子囊孢子。

二、 酿酒酵母细胞分裂的遗传控制
酿酒酵母细胞分裂途径: 减数分裂 接合型遗传控制、细胞接合和染色体 的减数分裂(包括孢子形成)。 有丝分裂 无性繁殖,称为细胞分裂周期。 酵母接合反应取决于a和α两种细胞接合型,该过程包括两 种细胞相混合、细胞停止生长形成接合管、细胞壁溶解、 细胞融合,随后核融合形成二倍体。

1. 酿酒酵母中与接合过程有关的基因及其功能

asg

α sg

hsg

表 18-2 酵母接合作用有关的基因及功能 基因 产物及功能 MFa1 MFa 2 a-因子 STE2 α -因子受体 STE6 分泌 a-因子所需 SsT1 分解α -因子(蛋白分解酶) MFα 1 MFα 2 α -因子 STE3 a-因子受体 STE13 α -因子加工 SCG1 G 蛋白α -因子 STE1 G 蛋白β -因子 STE18 G 蛋白γ -因子 STE5 活化 asg·α sg STE12 转录因子

STE7, STE11 激酶(蛋白磷酸化酶) Fus3 激酶,关闭细胞周期,开通接合 Kss1 激酶 fus1 细胞融合 far1 关闭细胞周期 Kar1 核融合 SIR 阻遏沉默暗盒的表达 HO 内切酶,起始交配型转换 SIN1-6 阻遏 HO 表达 SWI1-5 为 HO 表达导致转换所需 RME1 减数分裂和孢子形成的抑制因子 HML/HMR 储存沉默的交配型信息 asg: a 交配型特异基因群,α sg: α 交配型特异基因群,hsg: 单倍体 特异基因群,

?在a 细胞中,a 特异性基因组成型表达。但在α细胞中它 们的表达被抑制。a 特异性基因包括a 因子的结构基因、 STE2 基因, STE2是编码α因子受体的基因。所以a 表型 和对相反接合型产生的信息素的识别相联系。 ?α特异性功能基因在α细胞中表达,但在a 细胞中不表达。 它们包括α因子的结构基因,a 因子受体基因STE3 。同样, 一个类型信息素的表达与其相反类型信息素受体的表达相 关。 ?单倍体特异性的功能基因包括信息素和受体转录必须的基 因、和类型转换相关的HO 基因以及RME基因,RME基因 能够抑制产生孢子。它们在两种类型中组成型表达,但在 双倍体中却被抑制。同样,在双倍体中a和α特异性功能基 因不表达。

2. 接合信息素信号的传递 ?接合是由一种类型细胞分泌的信息素与另一种类型细胞携 带的受体相互作用开始的。一个接合型的细胞携带有另一种 接合型信息素的受体。当一个a型细胞和一个α细胞相遇时, 它们的信息素互相作用使各自的细胞复制停留在G1 期,然后 会发生各种形态上的改变。

?a细胞和α的接合过程是通过可扩散的a-因子和α-因子两种 信息素的相互交换而起始的。
?α型细胞分泌多肽α-因子;a型细胞分泌a-因子。α因子是 13 个氨基酸的多肽,由2个独立的基因MFα1和MFα2编码; a因子是12 个氨基酸组成的脂肽, 由MFa1和MFa2编码。a 因子上带有法呢基(Farnesyl,脂肪酸类似物)和羧甲基 (Carboxymethylation)。这两个多肽都是先合成前体多肽 然后再切断成为成熟的多肽片段。

a haploid
Surface receptor

Diffusible factor

α haploid
Surface receptor

a haploid

Factors bind to receptors

α haploid

Mating

α haploid haploid
a

a/α

diploid

MATa

MATα

MATa

MATα

Fig. The yeast life cycle proceeds though mating of MATa and MATα haploids to Give heterozygous diploids that sporulate to generate haploid spores.

?接合应答和经典的G 蛋白质受体偶联系统相似,受体是完整 的膜蛋白质(Ste2是a型细胞中的α受体;Ste3是α细胞中的a 受体;Ste,Sterile)当受体被激活时,它和G蛋白质相互作 用。 ?G蛋白质由3 个亚基组成,α、β和γ。在完整的G 蛋白质中, α亚基携带一个GDP。当信息素受体被激活时,使GDP被 GTP取代,结果α亚基从βγ亚基复合物上脱落。亚基的分离 使得G 蛋白质能够激活途径上其它的蛋白质。 ?βγ亚基激活下一步 此二聚体与骨架蛋白Ste5及PAK激酶 Ste20相结合,然后通过Ste11-Ste7-Fus3/Kss1级联反应 而使Ste12蛋白磷酸化,它依次激活接合所必须的基因,使 其转录。

交配型途径是通过释放β γ 而被触发的 因子

受体

α

β γ GDP

α GTP

β

γ

交配型途径 α 突变体具有组成型活性

受体

β

γ

由于细胞周期停止 组成型表达是致死的 β 突变体不能触发交配型途径

受体

γ GDP 由于对交配因子 无反应故不育

α

图 18-9 a 或α 因子与受体相互作用触发激活了 G 蛋白, 其β γ 亚基将信号转递给下一个蛋白(仿 B.Lewin: 《GENES》Ⅵ,1997, Fig .32.2)

?在酿酒酵母中, 磷酸化的Ste12 是一个控制不同 发育过程起始的 转录调节因子。 在单倍体细胞中, Ste12通过阻遏 hsg的表达和促 进与接合有关的 基因的表达,从 而促进接合生理 反应并最终形成 合子;在双倍体 细胞中,Ste12 是细胞生长所必 需的。

a-因子或α -因子

STE2=α -因子受体 STE3 =a-因子受体

SCG1 STE4 STE18
Gα Gβ Gγ

STE20 激酶 STE11 激酶 STE20 激酶 Fus1 激酶 细胞融合所需 Kss1 激酶 Fus3 激酶 抑制 CLN3 激活接合

STE12 转录因子

far1
抑制 CLN2

3. 接合型基因MAT在接合过程中的调控作用

?酿酒酵母的单倍体细胞a和α两种接合型,分别由MATa和 MATα基因决定;
?MATα编码α1和α2两种调节蛋白,α1激活αsg基因的表达, 而α2是一种同源结构域蛋白,阻遏性地抑制asg基因的表达,因 此在MATα细胞中表现出α型细胞的表型性状; ?MATa编码a1和a2两种蛋白,a2功能不清楚,与接合调控无 关,a1蛋白在单倍体细胞中不起作用,只在二倍体细胞中发挥 作用,在a型细胞中,asg基因可组成型表达,表现出a型细胞的 表型性状; ?在a/α二倍体细胞中,接合型基因以MATa /MATα二倍体的 形式存在, α2抑制asg基因的表达,同时α2和a1协同阻碍α1和 所有hsg基因的表达,因此细胞不再具备接合能力,而是激活二 倍体特异性基因的转录,信息素的信号系统也终止。

?MAT基因的基本作用是调控信息素基因,受体基因以 及在接合中起作用的功能基因的表达。

细胞型 交配 孢子形成 外激素 表面受体

表 18-1 交配型控制的各种活性 MATa MATα MATa/ MATα a α a/α 是 是 不 不 不 可 a 因子 α 因子 无 结合α 因子 结合 a 因子 无

α型单倍体中,产物α1 打开α特异性基因,它的产物对于α接合型是必须的。 表达产物α2 抑制那些负责编码和a 接合型相关蛋白质的基因,这是通过结 合在靶基因上游调节元件的序列来实现的。

(a) α -细胞 α 1 α 2 MATα

α 2

a-特异性基因

α -特异性基因

α 1

HO RME a/α -特异性基因

在a 型单倍体中,a型的接合蛋白质组成型表达。对于MATa 表达产物在细 胞中的作用现在还不清楚。也许它们只是在双倍体中抑制单倍体的一些功能。

b)a-细胞

a-特异性基因

a1
α -特异性基因 MATa

HO RME a/α -特异性基因

在双倍体中a1 和α2 合作来抑制单倍体特异性基因。它们识别一个不同于 α2 自己识别的操纵子序列。
(C) a/α -细胞 α 1 α 2 α -特异性基因 HO

a-特异性基因

RME MATa

a/α -特异性基因

a1

图 18-15 MAT 基因的调节功能(a) α -单倍体;(b)a-单倍体; (c)a/α 二倍体细胞 “ ” 转录; “ ”激活; “ ”抑制

a 功能 a 单倍体 组成型 No known functions 细胞 表达

α
功能

单倍体 功能

不表达 组成型 表达

HMLα

MAT a

HMR a

a1 α 2

二倍体 不表达 不表达 细胞

受阻遏

HMLα α 1 诱导α 接合

MATα

HMRa α 2 阻遏 a 接合

α 单倍体 受阻遏 被诱导 组成型
细胞 表达

图 18-16

asg ,α sg 及 hsg 在 a 细胞,α 细胞及二倍体细胞中的表达 (仿 B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997, Fig .32.6)

α2、a1 和α1 蛋白质调节转录的能力依靠它们之间 以及和其它蛋白质之间的相互作用。
?PRTF(pheromone and receptor transcription factor )蛋白质参 与了这些作用。PRTF结合在一些称为P-box的共有序列。 PRTF在基因调控中的作用非常广泛,因为P-box在基因中非 常常见。在一些位点中,P-box是一些活性基因所必须的; 但在另外一些基因中,PRTF起抑制作用。所以它的作用可能 依赖于其它结合在P-box 位点的蛋白质。 ?a特异性基因能够被PRTF激活,而a特异性基因在α单倍体 中的抑制是由α2蛋白质和PRTF蛋白质共同作用的结果。 ?α2 蛋白质有两个结构域,其C端结构域结合于含32bp保守 顺序的一端的短回文顺序上。但是与这个DNA片段的结合并 不能导致抑制,N 端是抑制所必须的,它负责结合PRTF。与 PRTF 结合的位点是位于调节元件中心的P-box。实际上, α2 是与PRTF协同的结合在调节元件上。

PRTF

?α特异性基因的表达需要α1 活化因子,α1 含175 个氨基酸。 负责α特异性转录的顺式作用序列只有26bp,前16bp形成Pbox,是PRTF的结合位点;后10bp是α1的结合位点。只有当 PRTF正结合在P box上时,α1 因子才能结合。
?在a 单倍体中α特异性基因被关闭是因为缺少α1因子,PRTF 不能够独自激活它们。 ?α2 蛋白质能够和a1 蛋白质合作。它们的合作能够识别另一 种调节元件。这个调节元件和α2单独识别的调节元件的回文序 列相同,但要短一点,因为处于它们之间的序列是不同的。在 双倍体中,α2/a1能够抑制带有这种模序(Motif)的基因。

a-specific genes PRTF activetes genes constitutively a haploid PRTF PRTF
CCATGTAATTACCCAAAAAGGAAATTTACATGG α 2 + PRTF repress a-specific genes N N α haploid α2 α2 C PRTF PRTF C CCATGTAATTACCCAAAAAGGAAATTTACATGG

α -specific genes Genes off: PRTF cannot bind without α 1 PRTF
TTTCCTAATTAGTNCNTCAATGNCAG α 1 enables PRTF to activate target genes PRTF PRTF α1 TTTCCTAATTAGTNCNTCAATGNCAG

α 2 + a1 repress haploid-specific genes α /a diploid α2 a1 α2

CCATGTNANTNNTATCATGG Fig. Combinations of PRTF,a1, α 1 andα 2 activate or repress specific groups of genes to correspond With the maping
type of the cell

三、 酵母接合型基因的转换

酵母的有性生殖取决于两个单倍体细胞的接合型,其接合型 的“性别” 是由其本身的遗传物质所决定的,是稳定的遗 传特征。 两个不同的接合型细胞可以接合形成二倍体合子,相同的接 合型细胞不能接合。但是接合型a可以转变成接合型α,相 反α型也可以转变成a型,这种现象称为接合型转换 (mating type conversion)。

?控制接合型的基因MAT位于酵母的第Ⅲ条染色体上,而 控制接合型转换的显性基因HO(homothallism)位于 另一条染色体上。
?当HO基因突变后,接合型转换频率下降到10-6。由于 HO基因的存在,一个只有一种接合型的群体,无论开始 的是什么接合型,在无性繁殖几代后就有大量的两种接合 型细胞,从而导致MATa/MAT α二倍体的形成并成为该 群体的主体,此即酵母中的同宗配合。 ?接合型转换的存在,表明所有细胞均含有成为MATa或 MAT α所需要的信息,但只有一种类型获得表达。

1. 酵母接合型基因结构 ?接合型基因MAT两侧有两个沉默基因座HMLα和 HMRa,它们与MAT位于同一条染色体,与MAT 分别相距180kb和150kb;

?HML和HMR含有与MAT相同的交配型基因,但 只有MAT座位的基因才组成型表达。

?活跃基因和沉默基因座位都含有Y区,但只有活跃基因座位

才表达,而沉默基因座位不能转录和表达。

HMRa HMRa
HMLα W= 723 bp W W

X=704 bp X=704 bp X X

Ya=642 bp Ya=642 bp Yα=747bp Yα Ya

Z1=239 bp Z1=239 bp Z1 Z1 Z2=88 bp Z2 Z2 Z2

MAT HMTα MATa HMTa

图 19-12 沉默暗盒和活性暗盒结构相同,但 HMRa 缺乏侧翼序列。

(参考 J.D.Watson et al:《Molecular Biology of the Gene》4ed. 1987,Fig.37.4)

?HML和HMR的两侧各有抑制表达的沉默子,位于HML上游和 下游的沉默子分别称为EL和IL,位于HMR上游和下游的分别称 为ER和IR。SIR(silent information regulation)蛋白通过 与E位点的相互作用抑制基因的转录。

SIR 1 SIR 2 SIR 3 SIR 4

W X EL

Yα Z

W X Yα Z MATα ER

X

Ya

Z

HMLα

HMR a

图 19-13 SIR 蛋白作用 E 区,关闭 HMLα 和 HMR a 的表达。

2. 接合型转换机理 ?转换是由于受体位点MAT的Yα或Ya被位于同一染 色体上的HMRa中的Ya或HMLα中的Yα序列所取代 而完成的,这种转换实际上是一种重组过程。

?这种基因转换是由HO内切酶所引发的。HO只对 MAT的Y区右侧的Y-Z交界处识别和切割,双链断裂, 产生出一个4bp的单链末端; ?随后,MAT两个游离的3’末端侵入供体座位(沉 默座位)的同源部分并与其中的互补链配对,再以 供体DNA为模板复制Y区,形成Holliday连接体, 然后拆分产生新的MAT座位。

Y region
T T T CAGCT T T CCGCAACAGTATA AAAGTCGAAAGGCGTTGTCATAT HO endonuclease GTATA T T GTCATAT

T T T CAGCT T T CCGCAACA AAAGTCGAAAGGCG

Fig. 19-18 HO endonuclease cleaves MAT just to the

right of Y region , generating sticky ends with a 4 base overhang.(仿 B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997, Fig .32.9)

MAT

HMR or HML

Cut at Y boundary

Pairing with donor

Degradation of MAT Synthesis of new DNA

Recipient DNA has changed mating type Donor DNA is unchanged Fig.18-19 Cassette substiution is initiated by a double-strand break in the recipint (MAT) locus, and may involve pairing oneither site of the Y region with the donor (HMR or HML) locus .
(仿 B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997, Fig .32.10)

?接合型转换是一个单向的过程,在这个过程中有一个接 受者(MAT),却有两个供体(HMR、HML)。a型细胞通常 选择HML为供体,α型细胞选择HMR 为供体。

?当基因型是HMLa和HMRα时,92%的取代是同源的, 一个a 被另一个a 所取代,一个α被另一个α取代,因为供 体的选择并不关心沉默位点的内容。 ?HO在G1期的限制性表达确保在MAT基因被复制之前就 发生接合型转换,结果导致两个后代有相同的新接合型。

α
在母细胞α 和子细胞

α a a a α a

α

a 细胞之间发生转换
转换后的第一代细胞 不发生转换 母细胞 a 和子 细胞α 间 发生转换

a

a

α

转换只发生在母细胞中; 图 18-20 转还只发生在目细胞中;两个子细胞具有新的 交配型。子细胞必须通过一个完整的细胞周期才能变成母 细胞,此母细胞又能发生转换 (仿 B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997, Fig .32.11)

3. HO的表达调控

HO基因的转录受几种调控影响:
① HO的转录受接合型基因的调控,它不在MATa/MATα 二倍体细胞内合成。 ② HO在亲代细胞里而不是子代细胞被转录。 ③ HO的转录也与细胞周期相关,该基因只在亲代细胞G1 期末表达。

?调控HO 基因的顺式作用位点位于基因上游1500bp 处。
?接合型的调控和其它单倍体特异性基因的调控相似,转录被 a1/α2 阻遏子阻遏。 ?SWI-SIN 的相互作用参与细胞循环的调控和母细胞HO的表达 调控。
?细胞周期控制位点是由9个拷贝的八核苷酸序列构成,位于-150~-900之间 的区域,称为URS2(upstream repressor sequences )。除在转到G1 期 末期的过渡时期外,与该序列相连的基因会被阻遏。SWI4 和SWI6 是激活 因子,能够释放URS2上的阻遏。它们的活性依赖于细胞周期调控因子CDC28 (cdc2和cdc28都编码一个34KD的蛋白激酶,促进细胞周期的进行 ) 的作 用,它能够决定细胞是否分裂。

?SWI5的作用是维持母细胞中的转录,其实际功能是阻遏SIN 3、4的表达。 这一系统作用于上游区(-1260~-1300)的DNA序列。SWI5本身服从于细 胞周期调节。
?SWI5 通过拮抗Ash1p 起作用。 Ash1p 是一个能够在细胞分裂后期的子细 胞内积累的阻遏子。ASH1 突变能够使子细胞转换类型。 Ash1p能阻止 SWI5 激活HO基因——通过与URS1启动子序列结合或与SWI5 蛋白质结合 来起作用。当子细胞发育成为母细胞时,Ash1p 被稀释,HO 基因的重新表 达成为可能。

一系列的控制系统可阻遏HO基因的表达,只 有在所有的阻遏都失败时HO才表达。

-1200

-1000

-800

-600

-4 00

-200 T TATA

起始点

HO 基因 由 SWI / SIN 基因控制 阻遏 转录激活 SWI4 SIN6 阻遏 SWI5 SIN3+SIN4 TCATGTNNANANNTACATCA a1/α 2 阻遏物
控制单倍体特异基因

控制 hsg 和细胞周期

CACGAAAA cdc28
控制细胞周 期

图 18-21 一系列的控制系统可阻遏 HO 基因表达,只有在所有的阻遏都失败时 HO 才转录 (仿 B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997, Fig .32.12)

第四节 酵母的载体系统

根据其功能可分为三大类:

克隆载体 表达载体 分泌载体 转化方法:电转化法 醋酸锂法

一、克隆载体
依据酵母菌质粒载体的构成和复制方式,克隆载体分为 五类: 整合型载体(integrative plasmid , YIp) 附加体载体(episomal plasmid , YEp) 复制型载体(replicative plasmid , YRp) 着丝粒载体(centromere plasmid , YCp) 酵母人工染色体(yeast artificial chromosome, YAC)

1.酵母整合型载体(YIp)

这类载体只含有大肠杆菌的复 制起点,不能在酵母菌中自主 复制。但可以与酵母染色体进 行同源重组,以低频率整合到 酵母细胞染色体上。整合位点 数取决于载体中的互补基因序 列数。

1个拷贝

通常以单拷贝存在,少数发生 多位点整合。大部分YIp质粒含酵 母菌选择标记(如HIS3、LEU2、 URA3等)。这种质粒的转化子很 稳定,可在无选择条件下培养很 多代而不丢失,但其转化率很低。

2.酵母附加体质粒载体(YEp)

这类载体属于自主复 制型质粒,除含有酿酒 酵母2μm质粒的复制起 点(2μm ori)和酵母选 择标记如URA3外,还含 有细菌的复制起点ori和 抗性选择标记基因(如 Ampr)。

50-100个拷贝

YEp载体的拷贝数多 (50-100)、稳定性好, 是酵母遗传工程中应用 最广泛的载体系统,常 用于酵母菌中的一般基 因克隆和基因表达的研 究。

3.酵母菌复制载体(YRp)

YRp含有酵母自主 复制序列(ARS), 可作为染色体外因 子复制并保留下来。 这类载体转化率高, 拷贝数高,但在减 数分裂和有丝分裂 中不稳定而使群体 内的拷贝数变化很 大。

高拷贝,不稳定

这类载体除含酵母自主复制 序列(ARS)外,还含有酵母 染色体的着丝粒(CEN),因 此能在染色体外自我复制。 在细胞分裂时新复制的质粒 均等分离,每一个细胞得到 1~3个质粒,故拷贝数很低, 但很稳定。 由于YCp的高稳定性和低拷 贝数,因此这类质粒适合做 亚克隆载体和构建酵母基因 组DNA文库,还可用于检测 有丝分裂中染色体倍性变化 和分析鉴定酵母基因突变等 研究。

4.酵母着丝粒载体(YCp)

低拷贝,稳定

5.酵母的人工染色体(YAC)

YAC(yeast artificial chromosome)是人工构建的具有 酵母染色体功能的人工染色体载体。 1983年Murray等人将酵母的着丝粒、自主复制序列及一 些标记基因与四膜虫大核 rDNA末端的端粒连接在一起,共 同构成了长度为55kb的酵母人工染色体。 1987年,美国华盛顿大学的Burke等人构建了能克隆大片 段的酵母人工染色体,这是真正意义上的第一代 YAC载体 系统。

1.YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因 ? 在 YAC 载体中最常用的是 pYAC4 。由于酵母的染 色体是线状的,因此其在工作状态也是线状的。但是,为 了方便制备YAC载体, YAC 载体以环状的方式存在,并 增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记,以 便保存和增殖。 ? YAC为能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分 离及保持染色体稳定的需要,必须含有以下元件: ARS、 CEN和TEL。

? YAC 载体的选择标记主要采用营养缺陷型基因,如 色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因 trp 1、 leu 2 和 his 3、尿嘧啶合成缺陷型基因 ura3 等,以及赭石突 变抑制基因 sup4 。与 YAC 载体配套工作的宿主酵母 菌(如AB1380)带有一个赭石突变 ade 2-1。带有这 个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落,当带有 赭石突变抑制基因 sup4 的载体存在于细胞中时,可抑 制 ade 2-1基因的突变效应,形成正常的白色菌落。利 用这一菌落颜色转变的现象,可用于筛选载体中含有外 源 DNA 片段插入的重组子。

YAC 文库装载的 DNA 片段的大小一般可达 200-500kb,有的可达 1Mb 以上,甚至达到 2Mb。

2.YAC载体的工作原理 BamHI BamHI

SmaI/EcoRI

BamHI

His3 TEL ori/Amp Trp1 ARS1 CEN4 Sup4 URA3 TEL

BamHI

SmaI

TEL ori/Amp Trp1 ARS1 CEN4

URA3 TEL

SmaI/EcoRI

原生质体和电转化 URA3/trp ade2-1赭石突

变株红色菌落插入失活

3. YAC 载体的优缺点

优点:
?酵母细胞比大肠杆菌对不稳定的、重复的和极端的 DNA 有更强 的容忍性。

? YAC 在功能基因和基因组研究中是一个非常有用的工具。
由于高等真核生物的基因大多数是多外显子结构并且有长长的内含子,大 型基因组片段可通过 YAC 载体转移到动物或动物细胞系中,进行功能研究。

缺点:
?在 YAC 载体的插入片段会出现缺失 (deletion) 和基因重排 (rearrangement) 的现象。 ?容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 YAC 中的插入片段由 2 个或多个的独
立基因组片段连接组成。嵌合克隆约占总克隆的 5%~50% 。

? YAC 染色体与宿主细胞的染色体大小相近,影响了 YAC 载体 的广泛应用。 YAC 染色体一旦进入酿酒酵母细胞,由于其大小与内源的染
色体的大小相近,就很难从中分离出来,不利于进一步分析。

酿 酒 酵 母 载 体 的 种 类 和 构 建

Ampr Tc
r

URA3

Ori

Amp

r


Ori

YIp

Tcr

ARS
Amp
Ori
r

Amp Tc
r

r

Tc

r

YEp


YRp
URA3

URA3

CEN
Ampr
TRP1 Amp Ori
r

Tc

r

pYAC
TEL
HIS4

Ori

YCp
URA3
TEL

TEL

Amp

r

YLp

URA3

Tc

r

TEL

TEL

二、酵母菌的表达载体(YXp) 酵母的表达载体包括酵母菌的强启动子、多克隆位点、终 止子。外源结构基因插入多克隆位点的适当酶切位点,在 强启动子的调节下,外源基因就可进行高效表达。 酵母的启动子至少含有3个成分:上游激活序列(UAS)、 TATA序列和起始密码子。酵母启动子分两大类: 第一类是来自编码解糖酶基因的解糖启动子,如ADH1、 PGK、GAP、ENO1等,这些启动子能在酵母菌中高水平组 成型表达; 第二类是强调节启动子,其中GAL1、GAL7和 GAL10是半 乳糖调节启动子。

三、酵母菌的分泌载体(YSp) 分泌载体是一种将基因产物分泌到胞外的一类载体。酵母 菌的分泌载体除必须含有表达载体的启动子和终止子外, 还需要在表达载体的起始密码子(ATG)的上游有分泌信号序 列。经常选用相同基因的启动子和分泌信号。最常用的是 MFα的信号序列。此外,酵母还能利用某些外源蛋白自身 的信号序列,例如E.coli的β-内酰胺酶,人α-和β-干扰素等, 但表达水平和分泌水平都很低。

第五节 酵母菌杂交系统 引言:
蛋白质间的相互作用是生命体活动的基础,在生命体生长 发育的各个阶段,都离不开蛋白质间的相互作用。随着生物 学技术的发展,人们已能通过各种方法来研究蛋白质间的相 互作用,如:
?蛋白质亲和层析(protein affinity chromatography) ?亲和印记(affinity blotting) ?免疫共沉淀(immunoprecipitation) ?交联(cross linking)(Phizicky,1995)等

传统的检测蛋白质相互作用的方法一般都是在生物体外进 行的,因此反映的也只是蛋白间的体外相互作用,而不能准 确地说明蛋白质在体内作用的方式。
由于生物体中蛋白质间的相互作用依赖于细胞内环境,环 境的改变有可能造成作用方式的改变,这使得传统的研究方 法存在很大的局限性。 针对以上问题,发展出了分子生物学方法,如以基 因文库为基础的蛋白探测(protein probing)、噬菌体 展示(phage display)及酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)等。

酵母双杂交技术是一种直接在酵母细胞内检测蛋白与蛋白相 互作用、灵敏性很高的遗传学方法,它是由Fields和Song (1989)最先提出并初步建立的。 酵母菌是真核生物,它的细胞内环境更接近蛋白质实际存在 的环境,因此该系统能更加准确地反应蛋白间的相互作用, 并能快速克隆编码与某一蛋白相互作用的蛋白的基因,因而 得到广泛应用。

一、酵母双杂交系统

1. 作用原理
许多真核生物的转录激活因子都是由两个或两个以上的在结 构上可以分开、功能上相对独立的结构域所组成的,其中有 DNA结合结构域(DNA binding domain,BD)和转录激活结 构域(activation domain,AD),这两个结构域是转录激活因子 发挥功能所必需的。 单独的BD可以和基因的上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)结合,但不能激活基因的转录;单独的AD由 于不能接近启动子,所以也不能激活转录。这样,当应用DNA 重组技术把BD和AD从形体上分开,并放置于同一寄主细胞中 表达,由于产生的BD和AD多肽彼此之间不会直接发生相互作 用,因此不能激活相关基因的转录。

真核生物转录激活因子由DNA结合结构域(DBD)和转录 激活结构域(AD)组成,是转录激活因子发挥功能所必需的
Upstream Activating Sequence

UAS

Promoter

Gene

Transcriptional factor DBD AD

将DBD克隆一个酵母表达载体上,构建成pASII 质粒,称为诱饵质粒(Bait plasmid)

Nco1

Sma1

BamH1 Sal1

CAT ATG GCC ATG GAG GCC CCG GGG ATC CGT CGA C

P(ADH) Amp

DBD

NLS

Term

pASII
TRP1 f1ori

ori

2u ori

CYH2

将AD克隆到另一个酵母表达载体上,构建成 pActII 质粒, 称为目标质粒(Pray plasmid)
Nco1 Sma1 BamH1 EcoR1 Xho1 CAT ATG GCC ATG GAG GCC CCG GGG ATC CGA ATT CGA

P(ADH) Amp ori

AD

NSL

Term

pActII
2u ori LUE2

?将编码蛋白质P1和P2的基因分别与BD和AD的基因 构建成融合基因,在宿主菌中表达出融合蛋白BDP1和AD-P2 ?P1和P2蛋白发生相互作用,则BD与AD在空间上接 近,形成有活性的转录激活因子,激活报告基因的 表达
(1)单独的AD-P2由于不能接近启动子,所以不能激活转录。 (2)单独的BD-P1可以和基因的上游激活序列(UAS)结合, 但不能激活基因的转录。 (3)当P1、P2蛋白发生相互作用时,导致了BD与AD在空间 上的接近,形成有活性的转录激活因子,就可激活UAS下游报 告基因的表达。

?酵母GAL4蛋白即是一种典型的转录因子. GAL4 的DNA结合结 构域靠近羧基端, 含有几个锌指结构, 可激活酵母半乳糖苷酶的上 游激活位点(UAS); 而转录激活结构域可与RNA 聚合酶或转录因 子TFIID相互作用,提高RNA 聚合酶的活性. 在这一过程中, DNA 结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。 ?通过把两种感兴趣的蛋白质中的一个与Gal4 DNA 结合区融合, 另一个与激活区融合,可检验这两种蛋白质是否在细胞中发挥相 互作用。如果这两种蛋白质在细胞内具有相互作用,那么Gal4 就 会装配成一个具有活性的类似于转录因子的结合蛋白,在它的激 活作用下,Gal1 启动子打开。若将lacZ 报告基因置于Gal1 启动 子的控制下,通过直接测定β-半乳糖苷酶的活力或利用培养基中 加有X-gal 的方法可检测到起相互作用的另一种蛋白质。 ?报告基因常为lacZ和His3 。常用的DNA结合域有Gal4 DB、 LexA DB(来自大肠杆菌),转录激活域有Gal4 AD、B42 AD(大 肠杆菌酸性激活域)、VP16 AD (单纯疱疹病毒的转录激活域)。

P1+DBD fusion

P2+AD fusion protein

P1 P2 on UAS Gal1 LacZ

P1 P2 on UAS Gal1 His3

P1 + P2 = Interaction

能生长,且 为兰色菌落 SC-Try-Lue-His- X-gal

P1

P2

P1

P2

off
UAS Gal1 LacZ UAS

off Gal1 His3

P1 +P2 = No Interaction

不能生长,即使生 长也是白色菌落

SC-Try-Lue-His- X-gal

酵母双杂交的实验流程
构建诱饵质粒(X-BD) 将质粒转化酵母菌 检测X-BD蛋白在酵母中的表达 通过酵母生长曲线检测X-BD是否有毒性 进行自激活测试

将文库质粒共转化入X-BD-酵母 筛选阳性克隆子(四缺,x-gal显色反应)

共转化再次确认相互作用
将阳性克隆子在二缺平板上划线3次 提取酵母质粒,转化E.coli,提取质粒 PCR或双酶切去除含有相同长度cDNA的克隆子 DNA测序

NCBI数据库搜索

举例

酵母双杂交前准备工作
诱饵蛋白的表达
1 2 3
4 3.5
AH109 IPO13-AH109 BD-AH109

构建诱饵质粒
M 1
21kb 5kb 3.5kb 2kb 1.5kb

检测诱饵蛋白是否有毒性

X-BD
OD600

3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 0 5 10 15 时间(H) 20 25 30

Gal4-BD

双酶切验证
M:marker 1:pGBKT7-BD-X

Western blot 1.Yeast 2.BD-yeast 3.X-BD-yeast

酵母生长曲线 1.未转化酵母 2.BD-酵母 3.X-BD-酵母

举例

酵母双杂交结果

X-BD+Gal4-AD

X-BD+Y-AD

Gal4-BD+Y-AD

Gal4-BD+Gal4-AD

SD/-Trp/-Leu SD/-Trp/-Leu

-Trp/-Leu/-His/-Ade -Trp/-Leu/-His/-Ade +3-AT (20mM) +3-AT (20mM)

举例

X-β-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析

X-BD+Y-AD

X-BD+gal4-AD

Gal4-BD+Y-AD

gal4-BD+gal4-AD

举例

酵母双杂交测序结果

酵母双杂交得到的阳性克隆子质粒经过DNA测序,由NCBI数据 库的BLAST检索cDNA编码的蛋白质

2、酵母双杂交系统的特点
1)有很高的灵敏性,可以检测到生物化学方法检测不到的相 对较弱及暂时的蛋白质间的相互作用。高敏感性主要是由于:

? 采用高拷贝和强启动子的表达载体,使融合蛋白过量表达。
?激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物之后又与 启动子结合,此三元复合体使融合蛋白各组分间结合更趋于稳 定。 ?通过mRNA使信号放大。 ?检测的结果是基因表达产物的累积效应,如酵母的表型,因 而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。

2) 酵母双杂交系统是直接在细胞内表达融合蛋白,减少了人工 纯化蛋白质的繁琐步骤。 3) 酵母双杂交系统是在活细胞内进行,蛋白质相对于体外更可 能处于天然状态,因此更能代表细胞内的真实情况。 4) 融合载体可以进行各种修饰以利于后续工作中确认蛋白质间 的相互作用。如BD和AD载体各自带上不同的表面抗原标记,可 以方便地用这些抗原的抗体来鉴定蛋白质。 5)是一个遗传学方法,是在细胞体内进行,类似于正常的蛋白 质-蛋白质相互作用。

酵母作为报告菌株的优点

?酵母内源性蛋白不易同来源于哺乳动物或植物的蛋白结合。 ?酵母的转化比较容易,已有的转化方法,如LiAc转化法,能 将转化效率稳定在104-105/ug。 ?酵母能同时容纳两种以上的质粒,从酵母中提取质粒也比较 方便。 ?酵母含有可直接进行选择的标记基因和特征性的报告基因, 如LacZ之类简单明了的报告基因,通过颜色反应即可验证。

3、酵母双杂交的应用
(1)检测已知蛋白间的相互作用:这是酵母双杂交系统最初 创建的目的。 (2)确定蛋白质相互作用的活性位点:在鉴定两种蛋白可发 生相互作用后,可通过其中一种蛋白的缺失或点突变体来找 出它们之间的作用位点。 (3)寻找与已知蛋白能相互作用的新蛋白:将一种已知的蛋 白与BD连接成融合蛋白,而要筛选的cDNA文库与AD连接成 靶蛋白,根据报告基因的激活与否,可从文库中找到新的结 合蛋白。

(4)寻找具有药物治疗作用的小分子多肽:基因治疗中常 用的一类药物就是多肽,利用酵母双杂交系统可以找到能与 靶蛋白相互作用的小分子多肽,从而揭示它们的作用机理, 为新药物的研制指明方向。

(5)寻找调控蛋白质相互作用的化合物:当已确定两种蛋 白能发生相互作用后,在恢复报告基因转录活性的双杂交系 统中加入某种化合物,如果它的加入可以抑制报告基因的表 达,就可利用这一化合物来阻止两种蛋白的相互作用。

(6)蛋白质相互作用图谱的绘制:随着后基因组研究的发展, 蛋白质在不同时空状态下相互作用图谱的构建也提上了日程。 将BD和AD的基因均与cDNA文库相连接,然后让它们一对一随 机表达蛋白,这样,通过对报告基因表达与否的检测,就可能 发现一系列的诸如A-B,B-C,C-D的全新的蛋白质间的相互作 用。
这就是Dunaief(1997)等提出的创建整个有机体蛋白质连锁图谱的设想 。 Fromont-Racine等人(1997)以10种功能已知的与mRNA前体剪接有关的蛋白质作 起始“诱饵”,从含有约5×106个克隆的酿酒酵母基因组文库中进行筛选。经过三轮 共十五次筛选,他们从中共得到约700个阳性克隆并且对大多数作了部分测序。他们 不仅发现了已知剪接因子与其他因子的相互作用,鉴定了一些新的因子,而且建立 了这个剪接途径与其他代谢途径的联系。

4. 酵母双杂交系统中常见的问题
(1)假阳性较多:通过双杂交观察到的蛋白质间相互作用,在 真实情况下不一定发生,也即所谓的假阳性。其产生的原因可能 是: a. 由于某些蛋白质本身具有激活转录功能或在酵母内表达时的转录激活作
用,使BD-X融合蛋白与AD-Y融合蛋白无须特异结合,就能启动转录系统。 如BD融合诱饵蛋白或AD融合靶蛋白能单独激活报告基因的转录;BD与AD融 合靶蛋白或AD与BD融合诱饵蛋白间可发生相互作用而激活报告基因转录。 b. 蛋白在细胞的正常生命活动中可能不会在同一时间存在于同一区域,报 告基因的表达只是因为人为地将它们聚在了一起。 c. 有些蛋白具有普遍的蛋白质相互作用,如一些蛋白水解酶。 d. 一些实际上不发生相互作用的蛋白质由于有相同的模体,如α-螺旋而 聚合在一起。

(2)转化效率较低:酵母的转化效率比细菌低4个数量级,而 在该系统中一般要进行两个或两个以上的质粒的转化,这使得 需要大量转化子的该系统工作量巨大。 (3)阴性干扰:两个蛋白本该发生相互作用,但报告基因不 表达或表达量很低以至检测不出,原因主要有融合蛋白的表达 对细胞有毒性,这时可选择低敏感性菌株或拷贝数低的载体; 蛋白间的相互作用较弱,这时可选择高敏感的菌株或拷贝数高 的载体;蛋白在宿主中的表达还可能不稳定,或不能被正确地 进行翻译后加工修饰,或不能被定位于细胞核。

5. 解决方法
(1)作严格的对照实验。对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报 告基因的鉴定。 (2)采用多个报告基因。如同时使用lacZ和HIS3报告基因, 可大量降低假阳性率。 (3)将报告基因整合到染色体上,可使表达水平稳定,消除 由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。 (4)对于转化率低的问题,Bendixen等人(1994)通过酵 母接合型的引进,避免了两次转化操作,同时又提高了双杂交 效率。

(5)得到阳性克隆后,要进一步做诱饵蛋白与潜在阳性克 隆间的免疫共沉淀分析,以证实这样的蛋白间相互作用可在 天然细胞中发生。 虽然酵母双杂交系统是一种在真核细胞体内环境发生 作用的系统,但是这毕竟与所研究的蛋白所处的天然环境有 所不同,这使得酵母双杂交系统的结果不如其它的生物化学 方法可信。因此酵母双杂交系统往往只是一个在研究课题初 期所采用的方法,从实验结果中得到的阳性结果一定要通过 其它实验手段,如免疫沉淀等去验证。

二、酵母单杂交系统

1. 酵母单杂交技术的原理
?酵母单杂交技术最早是1993年由Li et al从酵母双杂交技 术发展而来,酵母双杂交技术通过对报告基因的表型进行检 测以实现对蛋白质间相互作用的研究,而酵母单杂交技术则 通过对报告基因的表型检测,分析DNA、蛋白之间的相互作 用,以研究真核细胞内的基因表达调控. ?据此,可将GAL4 的BD置换为其他蛋白,只要该蛋白能与 目的基因相互作用,就可以通过其转录激活结构域激活RNA 聚合酶,从而启动对下游报告基因的转录。

?酵母单杂交系统由2 部分组成:(1)将文库蛋白片段与 GAL4 转录激活域融合表达的cDNA 文库质粒;(2)含 有目的基因和下游报告基因的报告质粒。

?在实验中,首先将报告质粒整合入酵母基因组,产生 带有目的基因的酵母报告株;再将文库质粒转化入报告 株;若存在文库蛋白与目的基因的相互作用,可通过对 报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来。在这里作 为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段,文库基因所编 码的蛋白就是启动子基因结合蛋白。

AD

转录因子
顺式元件 顺式元件 顺式元件 Pmin 报告基因

转录因子与顺式作用元件结合,激活最基本启动子Pmin(minimal promoter),使报告基因表达。若连接入3个以上顺式元件,可增强 转录因子的识别和结合效率。

2. 酵母单杂交技术的应用
酵母单杂交技术是建立在许多真核转录因子在结构和功 能上是由独立的BD和AD组成的基础上,这使得研究者可以构 建不同的基因融合体,在酵母中表达融合蛋白,以同时结合 特异的目的基因和激活转录. 理论上,在酵母单杂交技术中, 任何目的基因都可捕获能与目标因子特异结合的蛋白。 目前,酵母单杂交技术的应用可以归纳为以下二类: ?鉴别DNA 结合位点,并发现潜在的结合蛋白基因。目前对 于酵母单杂交技术的应用主要体现在这方面; ?对DNA 结合结构域进行分析。如果能得到DNA 结合结构 域的结构信息,就可以用酵母单杂交技术对该结构进行分析。

拟南芥cDNA插入片段

PADH1

GAL4 AD

TADH1

LEU2

转化
酵母转化体 DRE DRE DRE

DRE

Pmin

LacZ

URA3

筛选 挑取阳性克隆(蓝色菌落) 测序,进一步验证 结合活性
从拟南芥cDNA文库中筛选与顺式元件DRE结合的转录因子

3. 存在问题及解决办法
1) 在鉴别DNA结合位点中存在的缺陷 ?由于细胞技术的先天局限性,即影响因子多,因此,可 能有内源性的酵母表达激活物与DNA结合位点结合,并激活 报告基因的表达,则相应的目的基因片段可能因此而被漏 检。这个问题在试图鉴定某基因组中所有的DNA结合位点时 就会暴露出来。 ?此缺陷的补救需要一个更加随机的文库。例如,可以用 含有更多的已突变的片段构建一个随机剪切的DNA片段库。 ?另一个比较关心的问题就是此技术的检测灵敏度,有报 道显示此系统对于HIS3 基因表达是非常灵敏的,即使是很 弱的、甚或非特异性的相互作用都能被检测到,这些非特 异的相互作用可通过其他技术避免,但这也可能导致此方 法灵敏度的过度下降。

2)在DNA结合结构域分析中存在的缺陷 用酵母单杂交技术分析突变导致DNA结合结构域 改变的局限在于此方法的灵敏度依靠DNA结合结构域 功能选择,只有当突变影响了DNA 结合结构域的功能 时,才能被发现. 改进的方法是在培养基中选择合适 的半乳糖浓度,以减少杂交激活子的激活活性,或用 不同的阴性对照等方法。

三、酵母三杂交系统 1. 酵母三杂交系统的原理
?酵母双杂交系统将蛋白X、Y分别与特定转录调控因子 的DNA结合域、转录激活域杂合形成两个融合蛋白(XBD,YAD),当X 与Y 相互作用时,与X、Y 融合的BD, AD 在空间上接近,从而恢复该特定转录调控因子的转 录激活作用。

?酵母三杂交系统中,BD 与AD 的相互靠近由组分Z 桥 联X 和Y 来完成。组分Z可为蛋白、RNA 或小分子化合 物,根据组分Z 不同,酵母三杂交系统有不同的功能。

2. 酵母三杂交系统的应用
?分析蛋白质- 蛋白质间的相互作用 1)分析三个蛋白质之间的关系 ?Zhang等首次用酵母三杂交系统分析了GFR/Grb2/Sos(表皮生 长因子受体/ 衔接蛋白/ 鸟嘌呤核苷酸交换因子)复合体中三个蛋 白的关系。构建的2 个融合蛋白EGFR-Gal4 BD和Sos-Gal4 AD在 有Grb2表达质粒存在时,能成功地激活报告基因的表达,验证了 该系统用于发现三蛋白复合体的可能性。 ?用该法还可从cDNA 文库克隆桥联蛋白,也可直接从化学文库 中筛选影响三蛋白复合体形成的药物,阻断引发疾病的蛋白相互 作用,从而达到治疗的目的。 ?组分Z 也可以是不直接与X、Y 结合,而是通过改变X 或Y 的构 象,从而激活相互作用的酶。Osborne 等用IgE(免疫球蛋白E)受 体的γ 亚基,分离得到了一个新蛋白,而两者只有在酪氨酸激酶 Lck 存在时才相互作用。 ?应用该法能方便地研究需要转录后修饰的蛋白之间的相互作用。

2)分析配体与受体的关系 在信号通路研究中,跨膜受体 的细胞外结构域分别与BD、AD形成两个融合蛋白,配体 表达使受体二聚化,从而激活报告基因的表达。 ?分析蛋白质- RNA间的相互作用 ?酵母三杂交系统在活体细胞中检测相互作用,不需要纯化 RNA 结合蛋白,已广泛应用于蛋白质-RNA相互作用的研究。

?RNA 三杂交系统中,AD 与BD 的靠近是依赖于蛋白质-RNA 间的相互作用,组分Z 是一个杂合RNA(a-b)。当杂合RNA 的a、 b 序列能分别与蛋白X、Y 相互作用时,融合的AD 与BD 在空间 上相互靠近,报告基因被激活。
?X-a 一般为已知有相互作用的蛋白质和RNA,常为噬菌体 MS2衣壳蛋白与MS2 衣壳蛋白结合位点、铁调节蛋白(IRP1)与 铁效应元件(IRE)、HIV-1 Rev蛋白(病毒体蛋白表达调节因子)与 Rev 效应元件(RRE)。而Y、b 为待研究的蛋白质与RNA 序列。



?克隆RNA 结合蛋白 以RNA 作为诱饵筛选cDNA表达文 库,克隆特征未知的RNA结合蛋白基因。利用这一系统 已经成功地确定了20 多种RNA结合蛋白。

?寻找已知蛋白质的RNA目标 库中筛选蛋白Y的RNA目标。

用Y-AD作诱饵,从RNA文

?分析蛋白质-RNA反应的关键区域

?鉴定RNP复合体的组分 Rho和Martinis将亮氨酰tRNA 合成酶与bI4 成熟酶分别与LexA BD,B42 AD 构建成两 个融合蛋白,它们与bI4 内含子RNA 的结合直观地证实 了bI4 内含子剪接复合物的组装。

?分析蛋白质- 小分子化合物间的相互作用
小分子化合物与其蛋白质受体发生相互作用后, 会引发一系列生物学或药理学效应,但这些小分子化 合物的蛋白质受体还未被人们清楚地了解。酵母三杂 交系统的应用则让人们能通过大规模的筛选寻找答案, 其在药物发现中的重要意义在于:明确小分子药物的 作用靶点,阐明药物作用机制。

3. 酵母三杂交系统的局限
?由于三杂交筛选是在细胞核中进行,而细胞核并非 许多反应发生的最佳场所,如有些蛋白质需要胞质酶 的修饰,或在其定位到核时的错误折叠及不稳定性, 常不能检测到相互作用。 ?有些哺乳动物蛋白在酵母菌中不能正确折叠表达, 以细菌、哺乳动物细胞为宿主的杂交系统现已建立, 能更真实的模拟相互作用发生的自然细胞环境。 ?对不能被转运到细胞核的蛋白质,如跨膜蛋白和分 泌型蛋白,酵母三杂交系统则不能应用。

思考题
1、真核生物染色体的复制,严格依赖于哪几种DNA序列结构单 元?

2、何谓嗜杀质粒?其结构有何特点?
3、比较嗜杀型酵母和敏感型酵母有何不同? 4、接合反应如何起始?试述MAT基因在两种单倍体及a/α双倍体 中的调控作用

5、何谓接合型转换?控制接合型转换的基因受哪几种因素的调控?

6、酵母克隆载体依据其结构和复制方式分为哪几类?YAC主要的 结构特点?
7、试述酵母单、双、三杂交技术的原理和应用?

8、酵母双杂交系统在应用过程中存在哪些问题及其改进方法?



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